Способ выделения урокиназы из биологических источников

 

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ УРОКИНАЗЫ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ, включающий гидрофобную хроматографию, отличающийся тем, что, с целью увеличения удельной активности целевого продукта, хроматографию проводят дважды на колонке с бензилсефарозой в присутствии 20%-ного сульфата аммония, а элюцию урокиназы осуществляют формиатным буфером рН 4,0, причем первую сорбцию урокиназы на носителе осуществляют при рН 7,0, а вторую - при рН 4,0 с последующей гель-фильтрацией .

„„SU„„1 I 75965 А

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

151)4 С 12 N 9/12, 9/72, А 61 К 37/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1," . " ...,1- (21) 3603062/28-14 (22) 03. 05. 83 (46) 30.08.85. Бюл. № 32 (72) Б.Б.Егоров, Л.И.Михайлова, С.М.Дудкин, Б.С.Керницкий, Е. С.Северин и И.Ю.Саркисов (71) Институт медико-биологических проблем (53) 577.152.9(088.8) (56) 1. Whit e W. et а1. — "Methods

in Fnzymology", 1970, 19, 665 — 672.

2. Патент CIUA № 4259448, кл. 435-215, 1981 (прототип). (54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ УРОКИНАЗЫ

ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ, вклю— чающий гидрофобную хроматографию, отличающийся тем, что, с целью увеличения удельной активности целевого продукта, хроматографию проводят дважды на колонке с бензилсефарозой в присутствии

20Å-ного сульфата аммония, а элюцию урокиназы осуществляют формиатным буфером рН 4,0, причем первую сорб— цию урокиназы на носителе осуществляют при рН 7,0, а вторую — при рН 4,0 с последующей гель-фильтрацией.

1175965 2 обретение о ферме е ског бу по йвм

Из звод бопрои тром нно, к тносится к ратов а име кина зь препа ствия нтных о дей лучени едицин ству литич имепрепр ке, я уро ской спосо няемо практи бо эмб.о ственно при тром еваниях. имуще забол лических

Известен способ выделения урокиназы, включающий очистку фермента

10 с использованием сульфатаммонийного осаждения, многократного. центрифугирования, гельфильтрации на сефадексах, ионообменной хроматографии . 1 ).

Недостатки способа состоят в мно15 гостадчйности, трудоемкости и длительности процедуры.

Наиболее близок к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату способ очистки урокиназы, включающий гидрофобную и аффинную хроматографию биологических источников фермента (2 l.

Основные недостатки способа заключаются в необходимости предваритель- 25 ной концентрации выделяемого фермента и использовании обогащенных биологических источников.

Бель изобретения — увеличение удельной активности целевого продук- 30 та.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения урокиназы из биологических источников, включающему гидрофобную хро- 35 матографию, хроматографию проводят дважды на колонке с бензилсефарозой в присутствии 20Х-ного сульфата аммония, а элюцию урокиназы осуществляют формиатным буфером рН 4,0, 40 причем первую сорбцию урокиназы на носителе осуществляют при рН 7,0, а вторую — при рН 4,0 с последующей гель-фильтрацией.

Использование гидрофобного но- 45 сителя позволяет избирательно и практически полностью извлечь фермент, а путем изменения условий сорбции при повторной хроматографии удаляются балластные белки. 50

Способ выделения урокинаэы осуществляется следующим образом.

К среде кондиционирования клеток почек человека PH добавляют сульфат аммония до 20Х-ного насыщения 55 и доводят рН раствора 1 М трис до

7,0..Раствор пропускают через колонку, упакованную гидрофобным сорбентом и бензилсефароэои и уравнолешенную 0,1 М трис-НС1 буфером

7,0, содержащим 0,4 М !!аС1 и 20Х сульфата аммония. Колонку промывают уравновешивающим буфером и элюируют урокиназу формиатным буфером рН 4,0.

На второй стадии к элюату добавляют сульфат аммония до 20Х-ного насыщения, сорбируют его на той же колонке с бензилсефарозой, уравно— вешенной 0,05 М формиатным буфером рН 4,0, содержащим 20Х сульфата аммония, Колонку промывают уравновешивающим буфером. Урокиназу элюируют 0,05 М формиатным буфером рН 4,0.

Окончательную очистку осуществляют гель-фильтрацией на ультрагеле АсА 54. Белки элюируют 0,05 M трис-НС1 рН 7,5, содержащим 0,2 M

NaC1. Фракции, содержащие урокинаэу, диалиэуют и лиофильно высушивают.

Пример l. К 1 литру среды кондиционирования культуры клеток почек че:ловека RH, содержащей 35 МЕ урокиназы на мл, добавляют 106 г сульфата аммония до 20Х-ного насыщения, подводят рН до 7,0 1 М трис.

Раствор наносят на колонку 1 7 см, упакованную 20 мл бензилсефарозы, которая предварительно уравновешена

О,1 M трис-HCl буфером рН 7,0, содержащим 0,4 M NaC1 и 20Х сульфата аммония. Все процедуры проводят при комнатной температуре. Скорость нанесения среды кондиционирования

250 мл/ч. Колонку промывают с такой же скоростью уравновешивающим буфером до полного прекращения вымывания красителя, содержащегося в сре— де кондиционирования, и белков, не связавшихся со смолой. Урокиназной активности в этих фракциях не обнаружено. Связанный на колонке фермент элюируют 0,05 M формиатным буфером рН 4,0 со скоростью 40 мл/ч.

Удельная активность урокиназы после первой стадии очистки составляет 3800 МЕ/мг. Выход 92Х.

На второй стадии к 16 мл полученного раствора урокиназы добавляют

1,6 г сульфата аммония до 20X — ного насыщения. Вторую хроматографию проводят на той же колонке с бензилсефарозой, но уравновешенный

0,05 М формиатным буфером рН 4,0, содержащим 20Х. сульфата аммония.

1175965

Составитель В.Кузьмичев

Редактор Л.Пчелинская Техред С.Мигунова Корректор И.Муска

Заказ 5312/30 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

После нанесения раствора белка ко- лонку промывают 100 мл уравновешивающего буфера со скоростью 250 мл/ч, после чего урокиназу элюируют 0 05 М формиатным буфером рН 4,0 со скоростью 40 мл/ч.

Удельная активность урокиназы после второй стадии очистки составляет 42000 МЕ/мг. Выход 76Х.

Сконцентрированный ультрафильтрацией на амиконе (фильтр РМ-10 ) до 2 мл раствор урокиназы наносят на колонку l. 57 см, .упакованную . ультрагелем АсА 54 и уравновешенную 0,05 М трис-НС1 буфером рН 7,5, 15 содержащим 0,2 M NaC1. Скорость злюции белков 7 мл/ч. Фракции, содержащие урокиназную активность, диали-. зуют и лиофильно высушивают.

Удельная активность препарата 2б после последней стадии очистки составляет 190000 МЕ/мг. Выход 64Х.

Пример 2. Ц качестве исходного сырья используют обедненную среду кондиционирования культуры .25 клеток почек человека RH, содержащую 3 ME урокиназы на 1 мл.

На первой стадии аналогично примеру 1 получают урокиназу с удельной активностью 3350 ME/мг. Выход 3О

95Х.

Удельная активность урокиназы после второй стадии очистки составляет 38000 ME/мл. Выход продукта 70Х.

После последней стадии очистки удельная активность урокиназы

120000 ME/ìë. Выход 68Х.

Пример 3. Третьи порции среды кондиционирования культуры клеток почек человека ЙН объемом по 200 мл каждая с суммарной активностью урокиназы 5600 МЕ/мл (удельная активность 28 МЕ/мл ) обрабатывают аналогично примеру 1 на первой стадии хроматографии, но с измененной конечной концентрацией сульфата аммония на каждую порцию соответственно 10, 20 и 30Х. Выход продукта соответственно составляет 41,92 и 89Х с активностью урокиназы в каждой конечной порции:2300

5150 и 5000 МЕ/мл.

Максимальный выход продукта достигается при концентрации сульфата аммония 2ОХ.

Предлагаемый способ обеспечивает получение препарата урокиназы из обедненных сред кондиционирования, содержащих урокиназу до 3 ME/ìë, отличается быстротой очистки (до 1 сут )и высокой удельной активностью получаемого препарата урокиназы в результате исключения нескольких трудоемких процедур, таких как предварительная концентрация, диализ и центрифугирование, так как одновременно осуществляется концентрация и очистка фермента. По сравнению с известными предлагаемый способ значительно упрощен, поскольку на двух стадиях процесса используется одна и та же хроматографическая колонка.