Способ получения вектора,имеющего нуклеотидную последовательность,кодирующую протеин

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

Э

РЕСПУБЛИН

O% Ol) (др4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТ У

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

Il0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2770351/30-)5 (62) 2620106/28-13 (22) 18.05.79 (23) 26.05 ° 78 (31) 805023 (32) 09. 06. 77 (33) US (46) 15.01.86. Бюл, 11» 2 (71) Дзе Риджентс оф дзе Юниверси ти оф Калифорния (VS) (72) Вильям Дж. Раттер, Говард

Майкл Гудман, Джон Митчелл Чергвин (VS), Аксель Ульрих, Питер Хорст

Зеебург (DE), Джон Шайи (AU) и

Рэймонд Луис Пиктет (СН) (53) 575.2:576. 8.57 (088.8) (56) Ruogeon »F et al. Insertion of а rabbit beta globin gene sequence

into un Е. coli plasmid — Nucleic

acids Res",1975, 2» 2365 2378 ° ., (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕКТОРА, ИИЕЮЦЕГО НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ» КОДИРУЮЩУЮ ПРОТЕИН, включающий выделение клеток живот- ной ткани, экстракцию мРНК из клеток, кодирующей протеин в присутствии ингибитора РНК-аэы, выделение мРНК, последующий синтез комплемен- тарной ДНК и конструирование нуклеотидной последовательности, кодирующей протеин, о т л и ч а .ю щ и й— с я тем, что, с целью получения вектора, имеющего нуклеотидную последовательность» кодирующую гормон роста, в качестве клеточной ткани животного используют клетки гипофиза, в качестве ингибитора

РНК-аэы используют раствор 4М гуанидинэтиоцианата и О, 2 М бетамеркаптоэтанола, а вектор синтезируют путем реакции комплементарной ДНК с ДНК-молекулой, имеющей реакционнослособные концы, способные соединяться между собой или с комплементарной ДНК при условии предотвращения соединения реакционноспособных концов молекулы ДНК.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что для предотвращения соединения реакционноспособных концов молекулы ДНК, ее.обрабатывают щелочной фосфатазой.

1205777

Изобретение относится к способам получения ДНК-переносчика, имеющего нуклеотидную последовательность, кодирующую гормон роста.

Последовательность оснований ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) хранит генетическую информацию. и используется в качестве кода, в соответствии с которым клетка синтезирует последовательность аминокислот всех протеинов. Некоторые части этой последовательности являются регуляторами, контролирующими время и количество синтеэируемых протеинов

{природа этих контролирующих элементов исследована только частично).

Кроме тоги последовательность осно ваний в каждой нити используется в качестве шаблона для репликации ДНК, которая осуществляется при делении клетки.

Процесс, при помощи которого несущая генетическую информацию последовательность оснований в ДНК используется для образования последовательности аминокислот lIpoтеинов,в самых общих чертах является универсальным для всех живых организмов.

Установлено, что каждая аминокислота, содержащаяся в протеинах, определяется одним или несколькими тринуклеотидами или последовательностями триплетов. Для каждого протеина суще ствует соответствукщий сегмент ДНК, содержащий последовательность триплетов, соответствующих протеиновой последовательности аминокислот.

Генетический код представлен в таблице.

В биологическом процессе преобразования информации, содержащейся в последовательности нуклеотидов, в структуре последовательности аминокислот на первой стадии осуществляется транскрипция. На этой стадии локальный сегмент ДНК, содержащий последовательность, которая относится к определенному протеину, копируется на PHK (рибонуклеиновой кислоте). РНК является полинуклеотидом, аналогичным ДНК, но вместо рибо" зы здесь содержится дезоксирибоза, а вместо тимина используется урацил. о

Пары оснований в PHK могут быть взаимосвязаны также как и в ДНК.

Таким образом, в результате транскрипции PHK последовательности нуклеотидов из ДНК PHK становится

I9

IS

4О

Я комплементарной по отношению к после" дующему копированию. Такая PHK назы вается матричной PHK (мРНК) из-эа ее промежуточного положения между генетическим аппаратом и аппаратом синтеза протеина клетки.

Внутри клетки мРНК происходит сложный процесс, в котором участвуют различные ферменты и органеллы внутри клетки, в результате которого синтезируется определенная последовательность аминокислот. Этот процесс называется трансляцией мРНК.

В результате дополнительной обработ,ки последовательность аминокислот, синтезированная в течение процесса трансляции, превращается в функциональный протеин.

Нногие протеины, имеющие важное значение в медицине, в частности гормон роста, протеины, участвующие в механизме регулирования кровяного давления, а также большое количество других ферментов, обнаружены в клетках или вырабатываются. клетками высших организмов, например позвоночных. Однако получить их в необходимом количестве экстрагированием иэ организма, особенно из организма человека, очень трудно. Поэтому возникает необходимость в получении протеинов иэ искусственно выращенных клеток. Применение известных, способов выращивания биологической ткани нецелесообразно, поскольку клетки растут медленно, наблюдается их низкий выход, используется дорогостоящая среда для выращивания и условия выращивания необходимо жестко контролиро-, вать. Кроме того, как правило трудно подцерживать такие условия выращивания клеток, чтобы добиться искомых свойств деления.

Иик оорганиэмы, например, бактерии, относительно просто выращивать в среде, обладающей определенными химическими свойствами. Современная технология процессов ферментации в достаточной степени развита и хорошо поддается контролю. Микроорганизмы быстро размножаются, что обеспечивает их высокий выход. Кроме того, некоторые микроорганизмы достаточно хорошо исследованы с генетической точки зрения.

Таким образом, необходимо найти переносчика генетического кода протеина, представляющего медицинскую ценность, из организма, который вы рабатывает протеин, в нормальных условиях в подходящий микроорганизм.

В этом случае протеин синтезируется микроорганизмами при контролируе-, мых условиях роста и в необходимых количествах. Предлагаемый способ позволяет значительно снизить общую стоимость получения искомого протеина и обеспечивает, воэможность вьделения и транспортирования генетической последовательности, которая программирует получение определенного протеина в микроорганизме, имеющего вполне определенную генетическую структуру, а также исследования механизма синтеза такого протеина в контролируемых условиях и механизма дальнейшей обработI ки протеина после стадии синтеза.

Кроме того, выделенные генетические последовательности можно модифицировать с целью получения генетического кода для синтеза других протеинов, имеющих другие терапевтические или функциональные свойства.

Цель изобретения — получение вектора, имеющего нуклеотидную последовательность, кодирующую гормон роста, путем вьделения молекулы ДНК специ пьной последовательности нуклеотида и ее транспортировки в микроорганизм а также обнаружения исход7 ной последовательности нуклеотидов

ДНК после репликации в указанном организме.

Предлarаемый способ состоит иэ четырех основных стадий .

T. Вьделение искомой популяции, клетки из высшего организма.

Имеется два потенциальных источ.ника последовательности, несущей генетический код для синтеза протеина: сама ДНК организма-источника и

РНК, полученная после транскрипции на матрице ДНК. Мерами безопасности предусмотрено введение генов человека в рекомбинированную ДНК и затем в клетку бактерии только после их тщательного отбора при помощи специального оборудования, предназначенного для экспериментов, связан-ных с большой степенью риска (Р4).

В большинстве тканей желез или других органов клетки связаны между собой слоистой сетью соединительных тканей, которые состоят в основ205777

Например,при отделении мРНК гормона роста крысы (ГРК) обработка выращиваемых клеток гипофиаа крысы тироидным гормоном и глюкокортикоидами значительно увеличивает количество мРНК гормона роста.

П. Вьделение мРНК. Применение предлагаемого способа позволяет полностью вьделить активную PHK из экстракта клеток.

Выделяемая MPHK является одной полинуклеотидной нитью, не имеющей пары среди других комплементарных нитей ° Следовательно, гидролитическое рассечение одной фосфодиэфирной связи в последовательности может привести к образованию полной молекулы, которая непригодна для транспортировки полной генетической последовательности в микро" . организм. Широко распространенный, очень активный и исключительно устойчивый фермент PHK-азы находится на поверхности, обнаруживается при помощи известных способов промывки и иногда загрязняет используемые химические материалы, что особенно нежелательно при работе с экстрактами клеток поджелудочной железы, так как поджелудочная железа является источником пищеварительных ферментов и поэтому богата РНКазой. Однако проблема загрязнения

PHK-азой актуальна и при работе с другими тканями

Предлагаемый способ подавления активности PHK-азы применим к любым тканям, однако наиболее эффективен

Ф ном из коллагена, но могут содержать в зависимости от ткани и другие структурные протеины, полисахариды и минеральные отложения. При вьделении клеток иэ соединительной ткани необходимы специальные средства.

Таким образом, выделение и очистка типа клеток заключает в.себе две основные стадии: высвобождение кле-,, ток иэ матрицы соединительной ткани и отделение клеток искомого типа от всех клеток других типов, которые содержатся в ткани.

Содержание искомой мРНК можно увеличить используя способность клетки реагировать на внешние возмущения, например обработку популяции клетки гормоном, определенную темпе-, ратуру и использование специальных питательных или других химических веществ.

1205777

5 при выделении полной мРНК из отделенного участка ткани поджелудочной железы.

Согласно предлагаемому способу используются хаостропный анион, 5 хаостропный катион и разрывающий дисульфидные связи агент как при разрушении клетки, так и в течение всех операций, которые необходимы для вьщеления свободной PHK иэ 10 протеина. Эффективность комбинированного действия укаэанных агентов была доказана при их использовании для вьщеления полной мРНК с хорошим выходом из участков Лангерханса 15 поджелудочной железы крысы.

Выбор соответствующих хаостропных ионов зависит от их растворимости в водных средах. К хаостропным катионам относятся гуанидин, карбомоил-, гуанилгуанидин, литий и т.д.; к хаостропным анионам— иодид, перхлорат, тиоцианат, дийодосалицинат и т.п. Относительная эффективность солей, образованных 25 комбинированием таких катионов и анионов, частично определяется их растворимостью. . Например, дийодосалицинат лития обладает более сильным денатурирующим свойством, чем гуанидинтиоцианат, но его растворимость составляет всего 0,1 И и, I кроме того, он является относительно дорогостоящим материалом. Предпочтительно используют комбинацию катион-анион, так как она легкодоступна и хорошо растворяется в водных средах до 5 N.

Тиоловые соединения, такие как

Р-меркаптоэтанол,дитиотрейтол,цйстеин, пропанолдимеркаптан, исполь" зуются для разрыва внутримолекулярных дисульфидных связей в протеинах при помощи тиолдисульфидной реакции обмена. Наиболее предпочтительно применение р -меркаптоэтанола, поскольку он легкодоступен и имеет невысокую стоимость растворяться в воде, так как для доведения обменной реакции до конца необходимо, б чтобы .тиоловое соединение было в большом избытке по сравнению с, внутримолекулярными дисульфидами.

Эффективность хаоРгропного агента непосредственно зависит и от его концентрации; предпочтительно используется максимально возможная концентрация.

Ь

На выход неповрежденной мРНК на

I стадии выделения влияет скорость, с которой денатурируется PHK-аэа, а также масштаб процесса денатурации.

Поэтому преимущественно используют гуанидинтиоцианат по сравнению с гидрохлоридом, несмотря на то, что активность гидрохлорида в качестве денатурирующего агента лишь незначительно отличается от активности тиоцианата. Эффективность денатурирующего агента определяется пороговой концентрацией, которая необходима для достижения полной денатурации протеина, скорость которой зависит от концентрации денатурирующего агента относительно порогового значения, иэменяюп1егося, от 5 до 10-й степени. Поэтому денатурирующее средство, незначительно более сильное, чем гуанидингидрохлорид, может денатурировать протеин в несколько раз быстрее при той же концентрации.

Анализ показал, что целесообразно использовать денатурирующее средство с низким пороговым значением денатурирующей концентрации и высокой растворимостью в водной среде. Исходя из этого целесообразнее применять гуанидинтиоционат, а не дийодсалицилат лития, хотя последний обладает более сильным денатурирующим действием (растворимость гуанидинтиоционата намного выше, поэтому его можно использовать в концентрациях, при которых гораздо быстрее подавляется активность PHK-азы). Кроме того, гуанидинтиоционат по сравнению с гидрохлоридной солью, имеющей сравнимую степень растворимости, обладает несколько большей динатурирующей способностью.

Использование агента для разрыва дисульфидной связи в комбинации с денатурирующим средством увеличивает эффективность последнего, обеспечивая получение полностью развернутой молекулы PHKазы. Если некоторое количество

РНК-азы остается в качестве примеси в процессе получения мРНК, она неактивна даже при отсутствии денатурирующего средства и тиола. Аген ты для разрыва дисульфидных связей содержащие тиоловые группы, эффек-, тивны при любой концентрации, обесf5

35

В некоторых случаях, например когда в качестве источника мРНК используются клетки ткани с достаточно низким содержанием PHK-азы, для снижения активности PHK-азы 55 могут применяться известные способы, Ш. Образование кДНК (комплементарной ДНК).

7 !205 печивающей рассечение внутримолеку. лярных дисульфидных связей. Однако верхний предел концентрации ограничен тем, что соединения при высоких концентрациях зловонны. Уста- 5 ,новлено, что оптимальной концентра-.

1 цией Р -меркаптоэтанола является

0,05-1 0 M а для выделения полной

РНК из поджелудочной железы крысы концентрация составляет О, 2 М. 10

Величина рН среды в процессе ! экстрагирования мРНК из клеток может составлять 5,0 — 8,0.

После стадии разрушения клетки

РНК выделяется из основной массы протеина клетки и ДНК известными способами, например осаждением из этанола, в соответствии с которым

РНК селективно осаждается в осадок.

В соответствии с предлагаемым спо- 20 собом эту стадию можно исключить, при этом гомогенат вводят в раствор

5,7 M хлорида цезия, находящийся в камере центрифуги, что обеспечивает высокий выход РНК, свободной от ДНК и протеина.

В результате осуществления всех описанных выше стадий из гомогената клеток выделяется полная

f HK. Однако только часть этой PHK является искомой мРНК. Для извлеченця и скомой мРНК используется способность мРНК в клетках высших организмов после транскрипции присоединять полиадениловую кислоту.

Такая мРНК, содержащая последовательность полиЛ (аденин) которые присоединены к ней, может быть селективно выделена при помощи хроматографии на колоннах, содер40 ,жащих целлюлозу с присоединением . олиготимидилата. Выполнение всех описанных выше стадий достаточно для получения из источников, богатых PHK-азой, существенно чистой, полной, пригодной для копирования (трансляции) мРНК. Очистка мРНК и ,последующие лабораторные стадии могут быть осуществлены из клеток любого организма.

777

На чертеже схематически представоставшиеся стадии предлагаемого способа.

Первая стадия. Образование последовательности ДНК, комплементарной к выделенной мРНК.

В качестве фермента для данной реакции выбрана обратная транскриптиза, хотя можно использовать любой другой фермент, способный образовывать точную копию нити к ДНК, используя мРНК в качестве шаблона.

Эта реакция протекает при известных условиях с использованием мРНК в качестве шаблона . и смеси четырех дезоксинуклеоэидтрифосфатов в качестве предшествующих соединений для ДНК из одной нити. Для того, чтобы можно было следить за течением реакции, один иэ дезоксинуклеозидов трифосфатов метят при помощи Р в альфа-позиции; метку можно использовать и в качестве ориентира для извлечения продукта после стадии отделения, например, при хроматографии и электрофорезе, а также при проведении количественных оценок на стадии извлечения.

Как показано на чертеже, продуктом реакции с обратной транскриптазой является структура из двух нитей, имеющая форму приколки для волос, с нековалентной связью между нитью PHK и нитью ДНК.

Продукт реакции с обратной транскриптазой получают из реакционной смеси путем, например. Экстрагирования из фенола, хроматографии на сефадексе G-100 и осаждения из этано" ла.

После синтеза кДНК в результате ферментной реакции шаблон PHK можно удалить. Селекторное разрушение PHK в присутствии ДНК, по предлагаемому способу осуществляют щелочным гидролизом с высокой избирательностью и возможностью регулирования, обеспечивания необходимое эначени е величины рН.

После щелочного гидролиэа и последующей нейтрализации, если это необходимо, кДНК, меченная P может быть сконцентрирована путем осаждения этанолом.

Синтез имеющей форму приколки для волос молекулы кДНК иэ двух нитей достигается при помощи соответствующего фермента, такого как ДНК)2057!

20

50

55 полимераза или обратная транскриптаза. Реакционные условия аналогичны условиям, которые использовались ранее, включая использование меченного 4. — P нуклеозидфосфата. Обратную транскриптазу можно получить, например, из вируса avian тпа11оЬlastosis, После образования молекулы кДНК, имеющей форму приколки для волос, ДНК извлекают из реакционной смеси путем экстрагирования из фенола,, хроматографии на сефадексе С-100 и осаждения из этанола: при этом ДНК очищается от загрязняющего протеина.

Молекулу. ДНК в форме приколки для волос можно превратить в более предпочтительную структуру ДНК иэ двух нитей при помощи удаления петли из одной нити, соединяющей концы комплементарных нитей. Для этого проводят обработку ферментами, 1 пригодными для гидролитического рассечения фрагментов ДНК, содержащих одну нить, например Sl — íóêëåaçoé, выделенной из Aspergillus oryzae, в результате чего получают высокий выход молекул кДНК, концы которых ! соединены основанием. Затем осуществляют экстрагирование, хроматографию и осаждение из этанола.

При необходимости доля молекул кДНК, имеющих срез анные концы, может быть увеличена при помощи обработки

ДНК полимеразой-1, которая выделяется из микроорганизмов Е.со1 в присутствии четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов. Комбинированное действие ферментов эндонуклеазы и полимеразы приводит к удалению любого выступаюJ щего 3 -конца и к заполнению лц Э бого выступающего 5 -конца. При этом обеспечивается участие максимальной доли молекул кДНК в последующих реакциях с лигазами, Затем осуществляют обработку концов кДНК с тем, чтобы обеспечить соответствующие последовательности на калдом конце, содержащие места, узнавания для эндонуклеаэы ограничения ° Выбор участка ДНК, который присоединяется к концам, определяется материалами, с которь1ми пред-, стоит манипулировать ° Последовательность, которую присоединяют к кон-! цам, выбирают в зависимости от выбранного фермента эндонуклеазы ограничения, который,в свою очередь, 7,7 10 зависит от переносчика ДНК, с которым кДНК рекомбинирует. Выбранный при этом плаэмид должен иметь по крайней мере одно звено, по которому происходит рассечение при обработке эндонуклеазой ограничения, Например, плаэмид рМВЭ содержит одну точку ограничения для фермента Hind 111.

Фермент Hind Ш выделяют из бактерий

Hemophilus influenzae и очищают (CMHT Х.О., Уилкоксом К.В. J. Мо1.

Biol, 1970, 51/379). Фермент Нае Ш получают из Hemophilus aegyptions и очищают (Миддлтон Дж.Х. Эдгелем М,Н., Хатчисоном Ш, С.А. — J. л го1, 1972, 10, 42). Фермент, полученный из Hemophilus suis, названный Hsu 1, катализирует гидролиз тех же мест узнавания, что и фермент

klind 111. Следовательно эти два фермента могут заменять друг друга.

С целью присоединения к концам двойной кДНК предпочтительно использовать химически синтезированный декануклеотид из двух нитей, содержащий последовательность мест узнавания для фермента Hind Ш. Известны различные синтетические последовательностии мест узнавания, поэтому можно получить концы двойной ДНК, восприимчивые к действию любой из. эндону клеаз ограничения.

Присоединение последовательности мест узнавания к концам кДНК осуществляют известными методами. Выбор осуществляют на основе реакции, которая завершается лигацией срезанных концов, которая каталиэируется лигазой ДНК, очищенной по известному способу (Панет А. и др. Biochemistry„ 1973, 12,5045).

Продуктом реакции лигации срезанных концов между кДНК со срезанными концами и большим молярным избытком декануклеотида из двух нитей, содержащего в качестве эндонуклеазы мест узнавания фермент Hind Ш, является кДНК, содержащая на каждом конце последовательность мест узнавания фермента

Ыпй 1ц.. Обработка продукта реакции

1 эндонуклеазой Hind Ш приводит к рассечению молекулы в месте узнавания с образованием самокомплементарных молекул, состоящих иэ одной нити с концами 5 (см. чертеж).

Я, Образование переносчика рекомбинированной ДНК.

С целью образования рекомбинатов с кДНК можно использовать разные

1205777 12 жизнеспособные плаэмиды ДНК,Основные требования заключаются в том, чтобы переносчик ДНК мог проникать в клетку-хозяина, подвергаться в ней репликации и содержать генетический детерминант, при помощи которого можно было бы выбрать те клетки,, которые получили указанный переносчик. В качестве соответствующих переносчиков предпочтительно используют, в частности производные бактериофагов лямбда и производные плазмиды co E El.

Плазмиды, полученные из соl Еl, имеют молекулы относительно небольmoro размера, молекулярный вес по-: рядка нескольких миллионов и, кроме того, обладают тем свойством, что число копий плаэмид ДНК на одну клетку-хозяина может быть увеличено от 20-40 при нормальных условиях до 1000 и более при обработке этих клеток хлорамфениколом. Способность плазмид распространять генетические факторы внутри клетки-хозяина обеспечивает возможность при соответствующих условиях, контролируемых исследователем, заставить клеткухозяина вырабатывать протеины, генетический код на синтез которых был еренесен плазмидой. Таким образ: м, целесообразно, в качестве переносчика ДНК испольэовать производные, выделенные из соl Еl, в частности плазмиды рМВ- 9, несущие ген, контролирующий устойчивость к тетрациклину, а также рВР-313, рВР-3!5, рВР-316, рВР-317 и рВР-322, которые несут ген., контролирующий устойчивость к амплицилину. Наличие генов, контропирующих устойчивость к лекарственным препаратам, позво-, ляет селекционировать клетки, которые содержат плазмиды, так как популяции таких клеток выращивают в присутствии лекарственных препаратов.

Клетки, которые не содержат плазмид, не имеют воэможности расти или образовывать популяции. Согласно предлагаемому способу используют плазмиды, выделенные иэ соl. Еl, содержащие, одно. место узнавания для фермента Hind Ш.

Рекомбчнированные плазмиды образуются в результате смешения плазмиды ДНК, обработанной эндонуклеазой ограничения, с кДНК, содержащей концевые группы после аналогичной обработки. Для сведения к минимуму!

f5

40 вероятности образования комбинации сегментов кДНК друг с другом плазмиду ДЛК добавляют в молярном избытке по сравнению с кДНК. Это относится к большинству плазмид, которые исполь. зуются без введенного фрагмента кДНК.

Следовательно, трансформированные клетки не содержат рекомбинированных плазмид кДНК. Поэтому процесс селекции является очень трудоемким и продолжительным. Попытки синтезировать носители ДНК, содержащие места для действия эндонуклеазы ограничения, в середине соответствующего гена, так, чтобы введение рекомбината способствовало разделению гена, привели к снижению функции гена как носителя информации, Предпочтитель-но используют способ для снижения числа колоний, к которым затем применяют рекомбинированную плаэмиду, согласно которому отрезки плаэмиды

ДНК обрабатывают эндонуклеазой ограничения и щелочной фосфатаэой, вследствие, чего удаляются 5 -терми1 нальные фосфаты, находящиеся на концах, образовавшихся в результате действия эндонуклеазы, и предотвращается самолигация плазмиды ДНК.

Следовательно, образование цикла, а значит и трансформация, зависит от введения в молекулу фрагмента

ДНК, содержащего фосфорированные

5 -терминалы. Этот способ снижает относительную частоту трансформации при отсутствии рекомбинации до ме» нее 101;

Предлагаемый способ основан на реакции, катализатором которой служит лигаэа ДНК, между 5 «концевой фосфатной и 3 -концевой гидроксильной группами ДНК. Если терминальный 5 — фосфат отсутствует, то реакция не осуществляется.

Соединение ДНК из двух нитей представлено в таблице (концевые группы отмечены гидроксилом (ОН) или фосфатом(ОРОГОН ) .

В первом случае 5 -фосфаты находятся на обоих концах реагента, в результате чего между двумя нитями установлена ковалентная связь.

Во втором случае только одна из нитей, вступающих в связь, содержит ! терминальный 5 — фосфат, в результате чего между одной парой нитей установлена ковалентная связь, тогда как на другой нити разрыв сохра13

1205777

Схема реакции между 5 -концевой фосфатной и 3 -концевой гидроксильной группами ДНК, катализируемой лигазой

Случай

Реагенты

Лигаза

Н,О, РО

Р Ф

О - Р - О

ОРОСИ Н ОН вЂ” Р— О +2Н 0

1

H ОУРО

ОН

OH,ОН

ОН

ОН

ОН

ОН

Нет реакции няется. Нить, не содержащая ковалентной связи, остается связанной со всей молекулой благодаря связывающему взаимодействию между атомами водорода комплементарных пар оснований на противоположных нитях. В третьем случае ни один из концов не

1 содержит 5 - фосфата и реакция соецинения отсутствует.

Таким образом, нежелательных реакций соединения можно избежать, обработав соответствующие концы молекулы реагента с целью удаления

5 -оюсфатных групп любым известным способом,, не разрушающим структуру

ДНК, в -.астности гидролизом, катализируемым ферментом — щелочной фосфатазой.

Аналогичным способом выделяется кДНК, содержащая генетический код для синтеза ГРК, рекомбинируется с плазмидой и транспортируется в

Е.со1i После продолжительной репликации в Е,со1 выделяется последовательность нуклеотидов, содержащая приблизительно 800 нуклеотидов по длине. Было установлено,, что она содержит полную последовательность, содержащую гене ический

iG код для синтеза ГРК, а также некоторые части предшествующих пептидов и часть 5 — области, которая не

1 участвовала в трансляции.

Предлагаемый способ можно использовать для выделения и очистки генов высшего организма, включая гены человека, а также транспортировки их в микроорганизм для .:>епликаций.

В таблице приведены конкретные рб примеры выполнения предлагаемого способа.

16

1205777

20

Культивированные клетки гипофиза крысы (подклон семейства клеток

GH-1) использовали в качестве источника мРНК для синтеза ГКР. В этих клетках, если рост происходит в нормальных условиях, мРНК гормона роста содержится в небольших количествах 1 — 37 от общего содержания РНК, имеющей полиА. Однако, содержание мРНК гормона роста значительно увеличивается в результате стимулирующего действия тироидных гормонов и глюкокортикоидов. РНК выделяется из 5 10 клеток, выращиваемых в суспензии, в которую с . целью получения гормона роста за

4 дня до сбора клеток добавляют

1 мИ дексаметазона и 10 мМ L-трийодтиронина. Полиаденилированная

PHK выделяется из цитоплазменных разделяющих мембран культивируемых клеток известными способами. Полиаденилированная РНК, выделенная из гипофизных клеток, содержит мРНК, кодирующую гормон роста. Клетки делают более вязкими обработкой трипсина и обрабатывают ледяным

25 мИ раствором фосфата калия и

0,1 M NaCX при рН 7,4. Затем клетки инкубируют 10 мин при 0 С в 10 мМ

NaCf 10 мМ TE nc -НС2; рП 8,5 и . 3 мИ Mg< Т, 5 мп/г клеток. Далее. клетки разрушают в гомогенизаторе

Ф

Доунса. Ядра удаляют центрифугированием гомогената при 800 G в течение 5 мин. Супернатант изготовляют иэ 0,5 вес/об.) додецилсульфата натрия (НДС ), 1 MM этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) и 100 мМ

NaCE . РНК экстрагируют фенолхлороформом и осаждают 2 5 объемами этанола. Таблетку РНК, полученную центрифугированием осадка при 10000 G в течение 20 мин, растворяют в водном растворе, содержащем 0,57 (вес/об.) НДС, 5 мМ NaCf и 1 мМ ЭДТК, после чего инкубируют в течение

30 мин при 37 С вместе с 100 мг/мл самопереваренной проназы. Из инкубированной смеси PHK повторно экстрагируют фенолхлороформом и осаждают этанолом, после чего растворяют в воде до концентрации в 2 мг/мп и хранят при -60 С.

Получают 10 клеток — 10 мг цитоплазмовой РНК, включая рибосомную

PHK u PHK-переносчик, в дополнение к полиаденилированной PHK.

Полиаденилированную РНК выделяют при помощи хром а тогр афиче с ко ro анап иза всего препарата PHK на олиго-(дТ)целлюлозе. Выход 30 мг из 5õ108 клеток, Синтез двунитьевой кДНК (где одна нить имела нуклеотидную последовательность, комплементарную мРНК) завершают реакцией, катализируемой обратной транскриптазой,содержащей смесь деэоксиаденозинтрифосфат(дАТФ, дезоксицитидинтрифосфат (дЦТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ),дезок.ситимидинтрифосфат (дТТФ ), выделенную как описано выше мРНК, олиго-, дТ„т,ц -целлюлозу Supra и обратную транскриптазу., Обратную транскриптаэу, выделенную из вируса avian macloblastosis, используют для того, чтобы скопировать полную молекулу полиаденилированной PHK полученную из участков

Лангерханса крысы, на кДНК. Реакции осуществляют в растворе 50 MM трисHCP (рН 8,3), 9 мМ MgCE< 30 MM хлорида натрия, 20 мИ В-меркаптоэтанола, 1 мИ каждого из трех нерадиоактивных дезоксирибунуклеоэидтрифосфатов, 250 мМ четвертого дезоксинуклеозидтриофосфата, меченного P в альфаз позиции, с удельной радиоактивностью

50-200 Ки/моль, 20 мг/мл олиго-дТ .,, 100 мг/мл полиаденилированной PHK и 200 ед./мл обратной транскриптазы. Смесь инкубируют при 45 С в течение 50 мин. После добавления 45 мМ .

ЭДТК-Na,, раствор экстрагируют насыщенным водой фенолом, водяной слой хроматографируют на сефадексе

G-1ОО с колонкой диаметром 0,3 см и высотой 10 см в смеси IO мИ трисHCF. (р 1 9,0), 100 мМ хлорида натрия, 2 мИ ЭДТК. Нуклеиновую кислоту, элюированную в пустой объем, осаждают этанолом после добавления ацетата аммония, до 0,25 M (рН 6,0) .

Осадок собирают центрифугированием.

Полученный осадок растворяют в 50 мл свежеприготбвленного О,l М раство- . ра гидрата окиси натрия и инкуби-.руют при 70 С в течение 20 мин с целью гидролиза PHK. Смесь нейтрализуют добавлением IM раствора ацетата натрия (pEI 4,5), а меченную

31

P кДНК осаждают этанолом, а затем вновь растворяют в воде < Образовавшийся промежуточный продукт представляет собой однонитевую кДНК, 18

1205777

55 которую используют для синтеза требуемого двунитевого ДНК-продукта.

С целью идентификации однонитевую кДНК анализируют для выяснения возможности ее применения для синтеза гормона роста.

Отдельные порции кДНК, состоящей иэ одной нити, анализируют на натуральных полиакриламидных гелях.

Гели сушат и ДНК, меченную З Р, анализируют при помощи авторадиографии с использованием пленки Кос!аk Nosereen-2Т. При помощи диаграммы электрофореза установлено, что кДНК представляет собой гетеродисперсоид, После разделения при помощи электрофореза на геле, обнаружена слабая полоса поглощения, соответствующая ДНК с примерно 800 парами оснований, что характерно для кДНК, кодирующей гормон роста, Пример 1. Полученную кДНК, состоящую из одной нити, обрабатывают обратной транскриптазой с целью синтеза комплементарной нити, Реакционная смесь содержит

50 мМ трис-HC0(pH 8,3); 9 мМ NgCE, 10 мМ дитиотрейтол; 50 мМ трех немеченных дезоксирибонуклеози;,триофосфатов, 1 мМ меченного Р в альфа- позиции нуклеозидтрифосфата с удельной радиоактивностью 1-"1 О Ки/мМ „

50 мг/мл кДНК и 220 ед. /мл обратной транс криптазы. Реакционн„ло смесь инкубируют при 45 С в течение 120 мин.

1. еакцию прекращают добавлением

:ЭДТК-Na2 (до 25 мМ). Смесь экстрагируют фенолом и подвергают хроматографическому анализу на сефадексе G-100, а затем осаждают этанолом. Порции продукта реакции с показателем от 500 до 100 отсчетов в мин анализируют при помощи электрофреза на геле, Полоса поглощения гетеродисперсоица сосредоточена вокруг 800 нуклеотидов по длине, При обработке полной кДНК, на которой скопирована структура мРНК клетки гипофиза крысы, эндонуклеазой Hhal образуется два основных фрагмента ДНК (установлено при помощи разделения электрофореэом ), причем один содержит примерно 320 нуклеотидов (фрагмент А), а второй. 240 нуклеотидов (фрагмент В), На основе известной последователь-. ности аминокислот ГКР и других из-> вестных данных и гормонах роста установлено, что эти фрагменты являются в действительности теми частями, на которых: содержится генетический код, контролирующий синтез ГРК.

При воздействии на кДНК из двух нитей,, содержащую 800 пар оснований !

0 и выделенную при помощи электрофореза эндонуклеазой Hhal, при анализе среди основных продуктов рассечения были обнаруженыдва фрагмента,соответствукнцие по длине фрагментам А и В. г !

5 Таким образом, двунитьевую кДНК, содержащую примерно 800 пар оснований, получили с помо1цью реакции, катализируемой обратной транскриптазой, содержащей в начале ДНК, имекг20 щую нуклеотидную последовательность, кодирующую ГРК.

Так как кДНК, контролирующую синтез ГРК, содержащую приблизительно

800 пар оснований, не очищают перед

25 обработкой эндонуклеазой ограничения, ДНК необходимо подвергнуть обработке с тем„ чтобы удалить все несоединенные концы. Обработка с целью удаления таких непарных концов производится перед стадией разделения электрофорезом в смеси, содержащей 25 мл бО мМ трис-НС! (рН 7,5), 8 мМ хлорида магния, 10 мМ (P -мер-, каптоэтанола„ 1 мМ АТФ и 200 мМ каждого из дАТФ;дТТФ,дГТФ и дЦТФ.Смесь инкубируют с полимераэой 1 ДНК (1 ед.), выделенной из штамма Е. coli npu

lO С в течение 10 мин с тем, чтобы удалить все выступающие 3 -концы и

1»

1 заполнить все 5 -выступающие концы. кДНК, контролирующую синтез ГРК и соцержащую приблизительно 800 пар оснований, обрабатывают химически синтезированным линке— ром Hied Ш.

Полученный в результате реакции продукт, молекула которого состоит из двух нитей, с концентрацией

2-5 мг/мл обрабатывают 30 ед. S 1= нуклеаэы,имеющей активность 1200 ед/мл, в смеси, содержащей 0,03 М ацетата натрия, (pH 4,6) 0,3 М хлорида натрйя, 4,5 мМ хлорида цинка, при 22 С в течение 30 мин, а затем инкубируют еще в течение

15 мин при 10 С. С целью прекращения ферментной реакции в смесь добавляют трис-основание с конечной

12057 )0

20

30

55 концентрацией 0,1 м ЭДТК до 25 мМ и тРНК, выделенную из Е,соli äî

40 мг/мл. После экстрагирования реакционной смеси этанолом и хрома1ографического анализа на сефадексе G-100, меченную P кДНК элюизх руют в пустой объем и осаждают при помощи этанола. В результате. такой обработки обеспечивается высокий выход молекул кДНК, концы ! которой связаны основанием.

Декамеры Hind Н добавляют на каждый конец молекулы кДНК для обеспечения возможности соединения реакционноспособных концов гибридизацией или ковалентной связью кДНК, полученной, расщеплением векторапереносчика ограничительным ферментом Hind Ш. Лигация декамера

Hind )iE с кДНК осуществляется при помощи инкубации при 14 С в смеси

66 мМ трис-HC f (рН 7,6), 6,6 мМ хлорида магния, 1 мМ АТФ, 10 мМ дитиотрейтола, 3 мМ декамера Н пй Ц! с показателем 10 отсчетов в минуту и лигазы ДНК Т4, приблизительно

500 ед./мл в течение 1 ч. Для дезактивации лигазы реакционную смесь нагревают до 65 C и выдерживают в течение 5 мин. Предварительно к пищеварительным ферментам, содержащим 150 ед./мл Hsu l или Hind Ш, добавляют КСP с конечной концентрацией 50 мМ, P — - меркаптоэтанол с конечной концентрацией 1 мИ и ЭДТК с конечной концентрацией 0,1 мМ; смесь выдерживают в течение 2 ч при 37 С. Эндонуклеазы Hind Ш и

Нао Ш. Продукт реакции анализируют при помощи электрофореза на геле, при этом был обнаружен пик, соответствующий последовательности приблизительно 850 нуклеотидов наряду с отдельными фрагментами рассеченного декамера Hind Ш.

Плазмиду рВР-322, содержащую ген, контролирующий устойчивость к ампицилину, и единственное место узнавания для фермента Hind Ш, расположенное внутри указанного гена, рассекают в месте узнавания для

Hind Ш эндонуклеазой Hsu Т, затем обрабатывают щелочным фосфатом типа

PAPF. Фермент вводят в реакционную смесь с концентрацией 0,1 ед/мл

ДНК. Реакционну > смесь инкубируют в 25 мМ трис-HCP при рН 8 в течение

30 мин при 65 С, затем удаляют фос77 0 фатазу путем экстрагирования в феноле.

Полученный продукт представляет собой молекулу ДНК, приготовленную расщеплением вектора-переносчика (в данном случае плазмида рВГ-322) ограничительным ферментом (в данном случае эндонуклеазой Hind Ш), Перед фосфатазной обработкой расщепленные концы вектора-переносчика ДНК, генерированные в реакции расщепления

Hind П, способны соединяться друг с другом с помощью гибридизации или присоединяться к двунитевой кДНК с образованием гибридной или ! ковалентной связи. После осаждения этанолом плазмидную ДНК, обработан-„ ную фосфатазой, добавляют в кДНК, содержащую фермент Hind Ш, соединяющий концы молекулы, в молярном соотношении 3 моль плазмиды и 1 моль кДН К.

Судя по удельной радиоактивности, в реакции применено приблизительно

10-50 мг кДНК и 100 мг плазмидной

ДНК. Смесь инкубируют в смеси 66 мМ трис-НСГ(рН 7,6), 6, 6 мМ хлорида магния, 10 мМ дитиотрейтола и 1 мМ

АТФ в течение 1 ч при 10 С в присутствии 50 ед/мл лигазы ДНК Т4.

Смесь, в которой протекает лигация, добавляют непосредственно в суспензию штамма Е.co)i Х-1776, которую для трансформации приготавливают следующим образом.

Клетки выращивают до удельной плотности примерно 2x)08 клеток/мл в 50 мл среды, содержащей триптон

10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л, 40 хлорид натрия )О г/л, гидрат окиси натрия 2 мМ, диаминопимелиловая кислота )0 мг/мл и тимин 40 мг/мл при 37 С. Клетки собирают центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 6000 G при 5 С, вновь суспендируют в 20 мл холодного 10 мМ раствора хлорида натрия, центрифугируют, суспендируют в 20 мл буфера трансформации, сддержащем 75 мМ CaC)

140 мМ хлорида натрия и IO мМ трис (рН 7,5), затем смесь выдерживают в течение 5 мин на льду.

Клетки центрифугируют и вновь суспендируют в буфере трансформации 0,5 мл.

Трансформацию осуществляют путем смешивания 100 мл суспензии клеток с 50 мл рекомбината ДНК (1 мг/мл) .

Смесь инкубируют при 0 С в течение

21 1

15 мин, затем в течение 4 MHH npu

25 С и в течение 30 мин при 0 С. Кпетки переносят на питательный агар для роста в селективных условиях. Рекомбинированные,колонии

:селекционируют выращиванием на

I питательной среде, содержащей ампи" цилин, а если роста не обнаружиI вается, то на питательной среде„ содержащей тетрациклин с концентрацией 2 мкг/мл. Получено 10 таких колоний клеток, каждая из которых содержит плазмид с приблизительно

800 парами оснований, молекула которого разрывается под воздействием фермента - ..nd l4. Такие вводимые рекомбипатные плазмиды обозначают

РГРК. Для дальнейшего анализа выбрали одну колонию рекомбинированных бактерий, обозначенных Е.cali Х

Х-1776/РГРК-1. Из культуры Е.coli

Х-1776/РГРК-1 приготовили плазмиду

ДНК, обозначенную РГРК-1.

ДНК гормона роста крысы, содержащую 800 пар оснований, выделяют в препаративных количествах 5-30 мг из рекомбинированного клона РГРК-1 путем расщепления Hind Ш эндонуклеазой и анализируют .последовательность нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность содержит участки 5 областей, которые не участвовали в трансляции, а также последовательность 26 аминокислот, которые были обнаружены в протеине, предшествующем гормону роста, перед стадиеи выделения.

Таким образом, приблизительно

800 пар оснований выделены из плазмиды РГРК-1, закодированной для гормона. роста и представляющей собой вектор-переносчик ДНК, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую гормон роста.

Пример 2. Выделение мРНК, контролирующей синтез ГРЧ, проводят аналогично примеру 1, однако биологическим источником материала яв-. ляется ткань гипофиза человека..

Пять доброкачественных гипофизов человека, замороженных в жидком азоте после хирургического удаления, вес которых 0,4 — 1,5 r каждый, оттаивают и тонко измельчают в 4М растворе гуанидинтиоционата, содержащем 1М буферный раствор р -меркаптоэтанола (рН 5,0) при 4 С. Гомогенат наслаивают на 1,2 мл 5,7 M раст205777

22 вора хлорида цэзия, содержащего

100 мМ ЭДТК и центрифигируют в течение 18 ч со скоростью 37000 об/мин на ультра-центрифуге Бекман с ротором типа SM 50.1. При этом PHK собирается на дне пробирки. Далее, проводится очистка с использованием колонны на олиго-дТ осаждение при помощи градиентного раствора цукроЛЯ роста человека. Первые 23 аминокислоты гормона роста имеют вид. HzN-Phe-Pyo-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leuсб

2!)

ЗО зы. Примерно 10% выделенной таким образом PHK содержит генетический код для синтеза гормона роста, что установлено путем введения радиоактивного соединения, содержащего аминокислоты в гормон, подавляющий

;рост, который выпадает в осадок в системе клеток, в которых не происходила трансляция и полученных из зародышей пшеницы. кДНК гормона роста человека получают аналогично примеру 1. кДНК гормона роста фракционируют при помощи электрофореза на геле и материал с примерно 800 нуклеотидами по длине выбирают для размножения. Выбранную фракцию обрабатывают полимеразой 1 ДНК согласно примеру 1, затем обрабатывают линкером Hind 111 с целью сцепления концов. Далее кДНК рекомбинируется с плазмидой рВР-322, обработанной щелочной фосфатазой в присутствии лигазы ДНК. Клетки штамма Е. coli

X-! 776 трансформируют рекомбинантом

ДНК, а затем штамм„ содержащий ДНК гормона рсс-.s, извлекают. Штамм, содержащий ДНК гормона роста, выращивают в препаративных количествах, иэ него выделяют ДНК гормона роста, а затем определяют последовательность нуклеодидов. Было установлено, что выделенная ДНК гормона роста содержит нуклеотиды, содержащие информацию для синтеза полной последовательности аминокислот гормона

Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-А1а-HisArg-Leu-His-Glu- Leu.

Нуклеотидная последовательность одной нити ДНК гормона роста человека,а также последовательность ДНК,которая соответствует последовательности мРНК, контролирующей синтез ГРЧ (исключение составляет то.,что вмРНК V заменяет Т),. показаны ниже. Числа относятся к последовательности кислот ГРЧ,начиная с конечной аминогруппы.

23

24

1205777

»»

1 н ф

Я ф 3

-ф . д о

Ф и

Д

Л м а

0I

Л

Ф ч о. м

Л

4 ч

° (» и (Ч <

О 0 ц ц ® u

Ь М б о ф и н - o н с v

u a u

Ь Л и

g ф g

0» ц

8 и о н ф o о н о о и CJ н< ь4 и м

V) м о ц Ы ч ц î о м и и и

Я (-» ф и о

< u о и о о

Л ф н» н ц и ц. и ц и о э и н ф н

° 4 Я ф н

«л и ц

Й и г4 и и

«4 ц

Й н

C н о

i(a н н н и и са о (л н и н« ъ «4 н

00 О и ц и

И ц

4 ц и ъ

° ч ц ц

И н « » ц ц о и и о н

° «и и и » н о

00 Н ц и ц

° « ц ааа и н« (a» не

Ф . ц.-1 Д

С(,н «0 и

Iaa ,й о н о. (о Ф .Д л м э и

an

00 и и

3

- Л ,ц ц о

X о

«(» Д

< <

a«ц

:U o.. и

o .

u .

Р ц ц и

Р, д и о и и и о и а ц ф o ч ц о и (a, о и н ц и ц

Л

°,.

Л ц ц н н н и

Ф н .00 и и ц

Р»

Ф

Д ъ н ц ц ц и х и о и ц и и ц о о а ц О

»-a N ц ив

»« о и оо .Ьв н ц ц и

Са нм

1 н

3g Ц

Л и о

cl o н н н с ц

«ч

u o и Ц ц

Э и аа0 Н и ц и о и и и о и ц и и ц а. и ф ц э н» ц 5

° « ц и ц я и

g о о

С v ц б э и н н

Я и н

Щ и о4 о о» о

4 б

Д и н м и и . 4 а о

° л

Й и и

o u

Ю о

a(a o ,3

О» н в о о м и

«aa o ш н» а й. и о д н ц g и н

Еч и и и

З

Л мл о

< о ц

a u л

v и ц и ц

У.

c(u

4 ф и н ц

4 ц о о о и и о и и и и и д о о (ч

Ф н

"ы З о

0 ц

g е

° (, u б

И и

v o ф н о

° г ц

t» и ц н й

1205777

i rnRNA — л 9) s () » (A),<„ 9

5 - 3 над с ддр

Фг Ы//сФ

УССДДКСГгс (4jCCA

3 СЮC6AACС т)Е ! ржсггеа (л)сел ()gal

Т ТС6он5

446

77с(Заказ 8551/62 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытиф

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород,, ул. Проектная, 4

Составитель Т.. Полянская

Редактор Л. Пчелинская Техред И.Асталош Корректор И, Зрдейи