Меченный тритием хлорид тетрафенилфосфония в качестве индикатора на мембранный потенциал

 

Меченный тритием хлорид тетрафенилфосфоиия формулы CfeTsP CfcHsl Cr в качестве индикатора на мембранный потенциал. (Л jMr rV i // F ваму1/мти cuemfr a « и 1C 00 Од

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1217861

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Валуунмвм сиелтсмю

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3700061/23-04 (22) 24. 10.83 (46) 15.03.86. Бюл. 9 10 (71) Пермский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. А.М.Горького и ЛГУ им. А.А.Жданова (72) В.Д.Нефедов, М.А.Торопова, И.А.Скульский, Н.Е.Щепина, В,В.Аврорин и Н.И.Трофимова (53) 547.241(088.8) (56) Padan Е., Rottenberg Н. Respiratory control and proton electrochemical gradient in mitochondria.

Eur. J. Biochem. 1973, V 40, Р 2, р. 431-437.

Авторское свидетельство СССР

N 689196, кл. С 07 F 9/54, 1978. (5!! 4 С 07 F 9/54, А 61 К 31/66 (54) МЕЧЕННЫЙ ТРИТИЕМ ХЛОРИД ТЕТРАФИНИЛФОСФОНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРА

НА МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ, (57) Меченный тритием хлорид тетрафенилфосфония формулы

CsTsP (С6Н ) С! в качестве индикатора на мембранный потенциал.

1217861

Сравнение хроматографического проведения (CeTeP(CeHe)>)Cl и ((CeHe)ÄP) Cl на силуфоле (silufol uv-254) Таблица 1

Значения R, в системах

Соединение

БензолХлороформэтилацетат

85 -ная муравьиновая кислота (5:4:1) н-Бутиловый спиртуксусная кислотавода (4:1:5) этилацетат85Х-ная муравьино-. вая кислота (4:4:1) (С Ть Р(С Н ) (С1 ) (С Н )4Р)+С1

О, 18+0, 02 О, 17+0, 02 О, 19+0, 01

Изобретение относится к химии фосфорорганических соед*нений с С-P связью, а именно к новому соединению — меченному тритием хлориду тетрафенилфосфония формулы (С6Т Р. (САНЬ)3 С 1 ь который может быть использован для определения мембранного потенциала митохондрий.

Цель изобретения — йовьппение точности определения мембранного потенциала митохондрий и снижение токсичности индикатора на мембранный потенциал.

На чертеже представлена реакционная система для синтеза меченного тритием хлорида тетрафенилфосфония.

Пример. Получение меченного тритием хлорида тетрафенилфосфония.

В ампулу 1 через перетяжку 2 загружают 5 г зерен кварца размером

100-200 /" с предварительно нанесенным на его поверхность насыщенного спиртового раствора 20-30 мг NaC1 а затем 20 мг трифенилфосфина иэ бензольного раствора. В ампулу вводят

50 мкл гексатритийбензола с удельной активностью 2 Ки/мл. Перетяжку

2 перепаивают и реакционную систему выдерживают при 5ОС (твердая фаза) в течение 10-15 сут для накопления продукта реакции. Затем с помощью магнитного бойка 3 разрушают перегородку 4 и непрореагировавший бенэол перегоняют в новую реакционную ампу1 лу 5. Из ампулы 1 целевой продукт вымывают 5 мл воды. Выход 85+5X. Ана5 лиэ полученного продукта проводился по методам тонкослойной хроматографии и многократной перекристаллизации.

Из ампулы 1 непрореагировавший гексатритийбензол (вэятый в 5 кратном мольном избытке) перегоняют в новую реакционную ампулу 5, в кото-. рой находятся зерна кварца 5 г (размером 100-200) ) с предваритель-!

5 но нанесенным на их поверхность

20-30 мг NaC1, а затем 20 мг (Q Н )>Р.

Ампулу запаивают и выдерживают при

О С (снег) в течение 10-15 сут для накопления продуктов реакции, после

20 чего ампулу вскрывают. Отогнанный тритированный бензол пригоден для нового синтеза меченного тритием хлорида тетрафенилфосфония. Полученный целевой продукт вымывают через

25 зерна кварца 3-5 мл Н О (бидистиллят) . Выход 86+3X.

Хроматографический анализ полученного соединения показал его полную идентичность.немеченному хлориду тетрафенилфосфония.

Результаты тонкослойной хроматографии полученного соединения и нерадиоактивного хлорида тетрафенилфосфония представлены в табл.1..121?861

Индикаторные свойства нового соединения, его структурного аналога и эталона при определении мембранного потенциала митохондрий Т а б л и ц а 2

Токсичность

Точность определения (предельные концентрации) а

Соединение

10 — 10 М

Токсические эффекты

Валиномицин (комплекс сК или Rb) 10-9 10-1о М

С, Т Р «-ь Н,), BF

Токсические эффекты

10-9 — 10-10 М Не токс„„но

С T Ð (С, Н9)> 01

Дополнительные доказательства ониевой структуры соединения фосфора получены на основании постоянства массовой активности при многок ратной пе рек рис таллиз ации полученного продукта в присутствии нерадиоактивного хлорида тетрафенилфосфония.

Для определения мембранного потенциала митохондрий при помощи проникающего липофильного катиона тетрафенилфосфония, взятого в вйде хлористой соли, использовали митохондрии печени белой крысы, выделенные по известной методике. Суспензия митохондрий представляла собой изотонический раствор сахарозы 0,25моль/л и Трис-Cl буфер, рН 7,4. Исходная суспензия содержала митохондрии в ,концентрации около 50 мл белка/мл.

Для проведения опыта аликвота суспензии разбавлялась аналогичной средой в 100-200 раз. Затем производилась преинкубация рабочей суспензии ! со всеми ингредиентами, кроме радио. активного катиона. Хранение митохонд-, рий и все опыты проводились при 0 С.

Преинкубация была необходима для достижения стационарного распределения всех катионов между митохондриями и средой. Затем вносился радиоактивный катион тетрафенилфосфония (ТФФ ) и изучалась кинеФика его наИз данных таблицы видно, что применение нового соединения увеличива- ет точность определения мембранного потенциала по сравнению с эталоном копления в митохондриях. Для отделения митохондрий от среды применялось фильтрование через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,45мкм.

Митохондрии промывались на фильтре нерадиоактивной средой. Затем производилось определение радиоактивности митохондрий и среды и вычислялись коэффициенты накопления ТФФ

Мембранный потенциал рассчитывался по формуле Нернста с использованием данных о равновесном распределении ТФФ .

Одним из критериев хорошей сохранности митохондрий является их способность длительное время поддерживать достигнутый уровень стационарного распределения проникающего катиона. В

В опытах с ТФФ уровень накопления поддерживался в течение 1 ч и более.

Никаких токсических эффектов ТФФ не обнаружено. Проведенное морфологическое изучение митохондрий при помощи электронного микроскопа показало, что в структуре митохондрий не обнаружено никаких изменений, которые можно было бы приписать действию нового препарата.

Сравнение индикаторных свойств нового соединения, его структурного аналога и эталона приведено в таблице 2. валиномицином на несколько порядков, .а также не дает токсических эффектов, присущих эталону и структурному аналогу нового соединения.