Способ получения гриппозного антигенного нейраминидазного эритроцитарного диагностикума

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„„1256748 (5D 4 A 61 К 39/00, 39/12

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

Г

k "

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3784840/28-14 (22) 20.08.84 (46) 15.09.86. Бюл. Ф 34 (71) Одесский научно-исследовательский йнститут вирусологии и эпидемиологии им. И.И. Мечникова, Одесское предприятие по производству бактерийных препаратов и Московский научноисследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (72) Л.M. Трубина, И.А. Михова и И.Я. Мошиашвили (53) 615.373 (088.8) (56) Holston G.L. Dowdle W.R.

Applied MicroМо1о у. 1973, ч.25, Ф 1, р. 97-102. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГРИППОЗ—

НОГО АНТИГЕННОГО НЕЙРАМИНИДАЗНОГО

ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА путем сенсибилизации формалинизированных танизированных эритроцитов нейраминидазным антигеном вируса гриппа и выделением целевого продукта, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения специфичности, чувствительности и стабильности диагностикума, после сенсибилизации смесь центрифугируют, отделяют осадок и надосадочную жидкость, к полученной надосадочной жидкости добавляют IOX первоначального объема нового нейраминидазного антигена и сенсибилизируют новую порцию бараньих эритроцитов, смесь центрифугируют, отделя— ют осадок и надосадочную жидкость, Я к полученной надосадочной жидкости добавляют 207 первоначального объема нового нейраминидазного антигена и сенсибилизируют еще одну новую порцию бараньих эритроцитов, далее все полученные осадки объединяют.

12

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для приготовления гриппозного диагностикума.

Целью изобретения является повышение специфичности, чувствительности и стабильности диагностикума за счет повторного использования нейраминидазного антигена и смеси трех порций сенсибилизированных им эритроцитов.

Способ осуществляют следующим образом.

50Х-ную взвесь эритроцитов барана, формалинизированньж no Csizmaz L-, 1960, отмывают центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин

30-кратным объемом физиологического раствора рН 7,2-7,25 (раствор Р 1) и доводят до 2,5 .-ной концентрации раствором Р 2 (1/15 М фосфатный буФер рН 7,2-7,25, содержащий 0,85

НаС17". Отмытую 2,5 -ную взвесь формалинизированных эритроцитов смешивают с равным объемом раствора танина 1:20000, приготовленного на растворе N -2. Смесь выдерживают 10 мин при комнатной температуре (20 C), дважды отмывают 10-кратным объемом раствора Р 1, ресуспендируют до

2,5Х-ной концентрации в 1/15 Ii фосфатном буфере рН 6,4-6,5, содержащем 0,85Х NaCI (раствор N 3) и сенсибилизируют оптимальной дозой нейраминидазного антигена вируса гриппа °

Для выбора оптимальной сенсибилизирующей дозы нейраминидазного антигена в ряд пробирок с 5 мл 2,5Х-ной взвеси формалинизированных танизированных эритроцитов добавляют антиген в количестве 0,25-1,2 мл. После

20 ч контакта при 37 С к эритроцитам добавляют по 0,05 мл нейтрального формалина и через час контакта при тех же условиях сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают

40-кратным объемом раствора Ф 4 (забуференный 0,85Х-ный раствор NaCI, рН 7,2-7,25 с нейтральным формалином в конечной концентрации I ). К осадку эритроцитов в каждую пробирку добавляют по 5 мл раствора N - 2 и по 0,05 мл нейтрального формалина, выдерживают 12 ч в термостате при

37 С и с полученными диагностикумами ставят реакцию.

56748!

О

t5

2

Рабочей дозой нейраминидаэного антигена считают то его количество, при котором полученный диагностикум агглютинирует гомологичную сыворотку до наибольшего разведения при отсутствии реакции в контроле.

Выбранную дозу нейраминидазного антигена вируса гриппа в перерасчете на соответствующий объем добавляют к 2,5 .-ной взвеси формалинизированных танизированных эритроцитов, перемешивают в стеклянной емкости с резиновой пробкой и помещают в термостат при 37 С на 20 ч. Перемешивание производят каждые 2 ч.

После этого взвесь эритроцитов центрифугируют при 2500 об/мин без добавления формалина. К полученной надосадочной жидкости добавляют 10 . первоначального объема нейраминидазного антигена и при тех же условиях сенсибилизируют новую партию эритроцитов. Таким же образом надосадок используют в третий раз, добавляя к нему 20 первоначального объема нейраминидазного антигена.

Осадки сенсибилизированных эритроцитов трижды отмывают 40-кратным объемом раствора 11 4, доводят до

2,5 -ной концентрации раствором 92, добавляют нейтральный формалин до

IХ-ной концентрации и объединяют.

Готовые диагностикумы выдерживают в термостате при 37 С в течение 12 ч.

Пример. 5 мл 50 -ной взвеси эритроцитов барана, формалиниэированных по Csizmss, трехкратно отмывают центрифугированием при 2500 об/мин в течение 1О мин 150 мл раствора ВI.

Для приготовления 2,5Х-ной взвеси к 5 мл 50 -ной взвеси формалинизированных эритроцитов до 100 мл раствора В 2. Полученную взвесь эрит о троцитов смешивают с равным объемом раствора танина 1:20000. Танизация длится 10 мин при комнатной температуре (20 С) . Осаждение эритроцитов производят при том же режиме центрифугирования, после чего их трижды отмывают 300 мл раствора В 1.

1К осадку отмытых формалинизирован-ных танизированных эритроцитов добавляют 100 мл раствора В 3 для получения 2,5Х-ной взвеси; после чего производят сенсибипизацию эритроцитов нейраминидазным антигеном вируса гриппа, приготовленным твин-эфирным способом (разрушение вируса грипСоставитель М. Васильев

Техред И.Верес

Корректор О. Луговая

Редактор М. Циткина

Заказ 4854/3

Тираж 660

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектьая, 4

3 1 па твином-80 в конечной концентрации

0 2Х и .половинным объемом эфира без подщелачивания и использование для осветления препарата обработки фрео ном-113).

Рабочая доза нейраминидазного антигена штамма вируса гриппа А/Техас 1/77 (активность в единицах .экстинции Е 0,700/0,1 мл) сос.тавила 0,5 мл антигена на 5 мл

2,5Х-ной взвеси эритроцитов или

10 мл антигена íà 100 мл 2,5Х-ной взвеси формалинизированный тализиро.Ъанных эритроцитов. Смесь антигена и 2,5Х-ной взвеси эритроцитов помещают в термостат при 37 С на 20 ч, перемешивают каждые 2 ч. Через 20 ч контакта без добавления формалина взвесь эритроцитов цеитрифугируют.

Осадок сенсибилизированных эри" троцитов трижды отмывают 400 мл раствора Ô 4, ресуспендируют в

100 мл раствора У 2 и добавляют 1 мл нейтрального формалина.

256748 4

Отделенным надосадком (100 мл), к которому добавляют 1 мл нейраминидазного антигена, ресуспендируют до 2,5Х-ной концентрации осадок свежей порции отмытых формалиниэированных танизированных эритроцитов, помещают в термостат при 37 С на 20 ч при постоянном помешивании, после чего осадок эритроцитов обрабатывают, l0 как и в первом случае, а полученным надосадком (100 мл)после добавления

2 мл нейраминидазного антигена суспендируют до 2,5Х-ной взвеси осадок третьей порции формалинизированных

15 танизированных эритроцитов и обраба" тывают аналогичным способом.

Объециняют осадки и полученный таким образом диагностикум выдержи 0 вают 12 ч при 37 С.

Полученный диагностикум может использоваться в РНГА для диагностики гриппа и определения популяционного антинейраминидазного иммунитета,