СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫПРОТИВ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО ;ско-.ТА, включающий культивирование ви~ руссодержащих клеток, отделение клеток и вьщеление' • вирусного материала из культуральной жидкости,- отличающийся тем, что, с целью повьшения иммуногенных свойств вакцины, в качестве вируссодержащих . клеток используют лейкоциты периферической крови крупного рогатого скота, больного лейкозом, при этом отделенные клетки и вирусный материал подвергают разрушению с одновременным инактивированием содержащихся в них нуклеиновых кислот и последующим вьщелением белковых фракций р 25, и gP 70, используемых в качестве иммунизирзтещего агента.(Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУбМИК...Я1„1„„820015

-(50 4 А 61 К 39/12 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,, ц, ;

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ БЮЩщ, (21) 2502342/30-15 (22) 28.06.77 (46) 23.10.87. Бюл. ¹ 39 (71) Научно-исследовательский институт микробиологии им. Августа Кирхенштейна иМосковскаяветеринарнай акаде мия имени К.И.Скрябина (72) P.А.Кукайн, Л.И.Нагаева

В.П.Шишков, Б.З.Иткин, С.В.Чапенко, О.И.Брацславская, Т.Н.Ильинская, Г.В.Куделева, С.Я.Лагановский, Э.M.Нымм, 10.А.Симоварт, В.Т.Кумков

В.А.Крикун, Г.С.Петровский и А.Т.Шиков (53 ) 612.014:616.988.6(088.8) (56) Патент США № 3590128, -кл, 424-89, 1973.

Патент Франции № 2243702,. кл. А 61 К 39/12, 1975. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ

ПРОТИВ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО".СКОТА, включающий культивирование вируссодержащих клеток, отделение клеток и выделение - вирусного материала из культуральной жидкости, вЂ” о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения иммуногенных свойств вакцины, в качестве вируссодержащнх клеток используют лейкоциты периферической крови крупного рогатого скота, больного лейкозом, при этом отделенные клетки и вирусный материал подвергают разрушению с одновременным инактивированием содержащихся в них нуклеиновых кислот и последующим

Ю выделением белковых фракций р 25, и gP 70, используемых в качестве иммунизирующего агента.

8200

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности, к способам производства вакцйн против лейкозных заболеваний крупного рогатого скота.

В настоящее время известен способ получения вакцин против лейкозных заболеваний у различных животных.. В качестве примера можно указать спо10 соб получения вакцины для иммунизации птиц против лимфоидного лейкоза и эритробластоза путем получения смеси живых клеток и измельченных тканей, инфицированных этим вирусом

15 в фармацевтической жидкости, при этом концентрация смеси такова, что в 10-2000000 мл жидкости содержится

1 r смеси. B качестве исходного материала используют ткань почки сеЭ лезенки или печени больного животного.

Известна-также вакцина против лейкоза кошек, получаемая иэ клеток: культуры, инфицированной вирусом лейкоза кошки. Вакцина состоит из кле25 ток, зараженных вирусом лейкоза кошки или из инактивированных частиц вируса лейкоза кошки, выделенных иэ клеток культуры.

Однако вакцины, полученные известным способом, неэффективны для предупреждения лейкоза крупного рогатого скота. Кроме того, вакцины, полученные известными способами, содержат нуклеиновые кислоты как вирусного, так и клеточного происхождения, которые опасны как источник опухолевой информации с потенциальной воэможностью индуцирования опухолевого заболевания.Как недостаток известных способов следует отметить, что .для получения иммунизирующего материала требуется забивание животного вЂ” донора.

Целью настоящего изобретения яв- 45 ляется повышение иммуногенных свойств вакцины. В качестве вирусосодержащих клеток используют лейкоциты периферической крови крупного рогатого скота, больного лейкозом, при этом 50 отделенные клетки и вирусный материал подвергают разрушению с одновременным инактивированием содержащихся в них нуклеиновых кислот и после. дующим выделением белковых фракций 55 р 25 и gP 70, используемых в качестве иммунизирующего агента.

Пример 1. Из периферической крови методом гемолитического тока

15 2 эритроцитов с последующим восстановлением изотопичности раствора выделяют лейкоциты. После чего производят засев в культуральную среду следующего состава: инактивированная бычья сыворотка вЂ” 10Е, 0,5-лактагумин вЂ” 20Х, среда Игла вЂ” 70X. из расчета 5 10 клеток на 1 мл среды.

После 72 ч..культивирования отделяют культуральную среду, при этом осаждают лейкоциты центрифугированием при 1600-1800 об/мин в течение

20 мин.

Лейкоцитарные клетки разрушают в буфере А (неионный детергент тритон Х 100) до IX-ной конечной концентрации, затем производят обработку магнитной мешалкой в течение 1 ч при температуре +4 С, центрифугируют при 25000-30000 об/мин в течение

1 ч.

Супернатант подвергают диализу в течение,12-15 ч, после чего центрифугируют при тех же оборотах, отделяя антигенбелковую фракцию. Антиген подвергают лиофильной сушке. Полученный материал вводят в предлопаточный лимфоузел телятам в возрасте 1-3 месяца с полным адьювантом Фройнда в соотношении 1:1. Доза иммуногена определялась по белку, количественное определение которого проводилось по методу Лоури (журнал Biological

Chemistry, ч. 193, М 1, стр. 265, 1951).

Иммунизацию проводят трехкратно с интервалом 10-12 дней, Вторая, третья и четвертая иммунизация без адьюванта Фройнда. Через 4 недели после четвертого введения препарата в периферической крови иммунизиро ванных телят констатированы реципитирующие антитела к вирусным белкам

Р70 и Р25 в титрах 1:16-1:32. Напряженность иммунитета составляет

6 месяцев.

Пример 2. Культуральную жидкость после отделения лейкоцитов осветляют центрифугированием при

6000 об/мин в течение 20 мин, затем проводят дифференциальное центрифугирование при 30000 об/мин в течение

1,5 ч. Осадок ресуспендируют в буферном растворе THE растирают s поттере Даунса -и осветляют при

6000 об/мин, Полученный вирусный материал обрабатывают тритоном Х 100 до конечной концентрации 0,04Х и подвергают многократному криолизу.

40 з 8200

Полученный продукт деструкции вирусного препарата совместно .с полным адьюванч. м Фройнда вводят в шейный лимфоузел в следующих дозах по белку: 1-я иммунизация вЂ” 20 мг/мл, 2-я

30 мг/мл, 3-я - 50 мг/мл. Схема иммунизации аналогична примеру 1.

Титр антител к вирусным белкам через

3-4 недели равен 1:8-1:16.

П р и м е p 3. Выделяют белковые фракции Р25 и gP70 следующим методом.

Вирусный материал, полученный в примере 2, очищают дважды в градиенте сахароэы 15-60Х, обрабатывают тритоном Х 100 до концентрации 0,005Х и помещают в термостат при 37 С на 1 ч..

Полученный материал осветляют при

30000 об/мин в течение 90 мин, под-! вергают диализу против фосфатного бу20 ферного раствора в течение суток при

+4 С, вновь осветляют при .6000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант подвергают фракционированию на аппарате изоэлектрофокусировки. Собранные белковые положительные фракции в реакции

ИД в агаре объединяют, рН эоны 7,27,5 (пик 7,4). Затем полученный материал подвергают диализу против о

0,01 мл фосфатного буфера при +4 С в течение суток со сменой буфера.

Материал концентрируют акрилексом; очищают на колонке ифадекс Д-100., Выделенные белковые фракции совместно с полным адьювантом Фройнда вводят в предлопаточный лимфоузел в следующих дозах по белку: 1-я иммунизациявЂ”

10 мг/белок, 2-я вЂ” 15 мг/мл, 3-явЂ”

25 мг/мл. Схема иммунизации аналогична примеру 1.

Титр антител через 3-4 недели после 3-ей иммунизации равен 1:321:64.

Пример 4. Из периферической крови больного лейкозом крупного рогатого скота животного выделяют клет-. 45 ки, как описано в примере 1. Полученные нативные клетки разрушают в буфере А (Неионный детергент тритон

Х 100) до 1Х конечной концентрации.

Затем производят обработку на маг- 50 нитной мешалке в течение часа при температуре +40 С, центрифугируют при 25000-30000 об/мин в течение часа. Супернатант подвергают диализу в течение 12-15 ч, после чего центрифугируют при тех же оборотах, отделяя белковые фракцйи Р25 и gP70вЂ” антиген, который подвергают лиофильной сушке.

15 4

Полученный материал вводят в надлопаточный лимфоузел телятам в возрасте 1-3 месяца с полным адьювантом

Фрейнда по белку: 1-я иммунизациявЂ”

25 мг/мл, 2-я иммунизация вЂ” 37,5 мг/мл, 3-я вЂ” 60 мг/мл.

Схема иммунизации аналогична примеру 1. Титр антител к вирусным белкам 3-ей иммунизации через 4-5 недель равен 1:16-1:32 °

Пример 5. Культуральную жидкость 72-х часовой культуры лейкоцитов, полученных от больных животных1 сливали, осветляли при 5000 об/мин. в течение 10 мин, затем при

12000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость собирали и "центрифугировали при 30000 об/мин (950000 6) на центрифуге VAC-601 в угловом роторе 6 85 мл в течение

1,5 ч. Полученный осадок ресуспендировали в малом объеме б„ TNE содержащего 0,01 M Трис-HCl; 0,1 M

NaCl; 0,001 М .ЭДТА рН - 7,4, гомоге- низировали в стеклянном гомогенизаторе. Гомогенат центрифугировали при

8000-9000 об/мин в течение 30 мин.

Надосадочную жидкость подвергали очистке, пропуская материал через слой 20Х раствора сахарозы при

30000 об/мин в горизонтальном роторе центрифуги VAC-601 в течение 1 ч..

Осадок после данного этапа очистки .снбва суспендировали в буфере TNE гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе и подвергали очистке в линейном градиенте концентраций сахароэы. Градиент готовили при помощи градиентообразователя из 15Х и 60Х растворов сахарозы.. На приготовленный градиент наслаивали вирусную сусненэию, очищенную через слой 20Х раствора сахароэы. Центрифугировали в горизонтальном роторе 3 30 мл центрифуги VAC-601 при 3000 об/мин в течение 4-х ч. Градиент после центрифугирования фракционировали и фракции собирали при помощи перистальтического насоса-КВ или автоматической системы регистрации "Uvicord" и фрак-, ционного коллектора установки "Colo- .

ra" (ЬКВ-Швеция). Фракции с плотностью:l 16-1,18 г/мл собирали, переосаждали при,30000 об/мин (95000 g) в центрифуге ЧАС-601 в течение 1 ч.

Собранные осадки ресуспендировали в

TNE буфере, разливали во флаконы или ампулы и хранили при -190 С (срок хранения 6-8 месяцев).

5 8200

Пример 6. Антигенные экстракты. а) Клетки 72-х часовой культуры ,лейкоцитов, полученных от больных лимфолейкозом коров были собраны, отцентрифугированы при 1200 об/мин . в течение 20 мин, отмыты три раза

0,85% раствором NaC1 с последующим осаждением при 1200 об/мин в течение

20 мин, Клетки лизировали, ресуспендируя их в буфере А, содержащем

0,02 M Трис-НС1; 0,3 M КС1, 0,01 М азида Na и 1% тритона Х-100; рН-7,8.

Суспензия встряхивается на холоде (+4 ) в течение 1 ч, осветляется о

15 центрифугированием при 24000 g (20000 об/мин) в течение 45 мин (+4 ). Надосадочную жидкость собирали, диализировали против дистиллированной воды (1:2000) в течение суток. Экстракты после диализа вновь ,осветляли при 24000 я вЂ” 45 мин (+4 С). б) антигенные экстракты из очищенного и концентрированного вируса

БЛВ °

Вирус, очищенный двумя циклами дифференциального.центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности сахарозы 15-60%, ресуснендировали в TNE буфере, содержащем

0,01 M Tpuc-HCl 0,1 M NaC1, 0,001 M .

ЭДТА; рН вЂ” 7,4.

Вирус разрушали добавлением к сус- З5 пензии тритона Х-100 в концентрации с

0;5/ инкубировали смесь с тритоном, в течение 1 ч при 37 С. После инкубации смесь центрифугировали при

30000 об/мин в течение 1,5 ч. Осад- 40 ки после центрифугирования отбрасывали, надосадочную жидкость диализовали против воды (1:400) за ночь при

+4 C с двумя сменами воды. Материал повторно осветляли центрифугированием

45 при 6000 об/мин в течение 10 мин.

Пример 7. Антигенные экстракты клеток и вируса (описано выше) наносили в колонку LKB (110 мл) для, изоэлектрофокусирования. Условия изоэлектрофокусирования.: амфолины50

1%; диапазон рН 3-10; начальные параметры:-V вЂ” 300 В, I вЂ” 8 мА; ЧвЂ”

2,4 Вт; конечные параметры: V вЂ” - 300 В;

Х - 0 ° 8 мА;. Ч вЂ” 0,24 Вт; время фоку сирования вЂ” 48 ч.

Собирали фракции с колонки по

40 капель с одновременным измерением рН и А, (оптической плотности), Все собранные фракции тестировали в иммунодиффузии. Собирали фракции, положительно реагирующие с сы- вороткой крупного рогатого скота, специфичной к р-25 БЛВ.

Положительно реагировали фракции в зоне рН 7,3-7,5, пик активности вЂ” в точке рН 7,4, Положительные фракции собраны, отдиализованы против 0,01 M фосфатного буфера.

Следующий этап очистки проводили на колонке с сефадексом Г-100 (1,5» х100 см с водяным охлаждением).Сефадекс -Г-100 предварительно многократно отмывали от мелких частиц и уравновешивали буфером, содержащим

0,05 М Трис-HCl, рН вЂ” 7,8; 0 3 M.

KCl, 0,01% тритона Х-100.

Фракции колонки проверяли в иммунодиффузии со специфической сывороткой. Собирали положительно реагирующие фракции. Очищенный таким образом белок в полиакриламидном геле при электрофорезе дает полосу в зоне с молекулярным весом 25000 дальтон.

Пример 8. Выделение двойного антигена. Вирус концентрируют из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры сульфатом аммония.

Для этого; к культуральной жидкости добавляют сухой сульфат аммония из расчета 30 г/100 мл среды; охо лаждают при 4 С в течение ночи; центрифугируют при 1000 об/мин 1 ч и надосадочную жидкость сливают; осадок ресуспендируют в дистиллированной воде 1:10 объема; охлаждают ночь и центрифугируют при 1000 об/мин

30 мин. Надосадочную жидкость оставляют, осадок отбрасывают; надосадочную жидкость диализуют против фосфатно-солевого .буфера; после диалиэа жидкость концентрируют ультрафильтра-, цией (Amicon вЂ” аппарат, мембраны PM10) в 100 раз rio отношению к исходному объему; после концентрирования материал центрифугируют при 30000 g a течение 1 ч. Супернатант собирали. Он содержит оба антигена - P-24 и гликопротеин.

Таким образом, разработан способ получения эффективной и безопасной вакцины против лейкоза крупного рогатого скота, при котором животноедонор остается живым. В результате: применения данной вакцины получены

820015

Редактор Н. Сильнягина

Техред А. Кравчук . Корректор Л. Патай

Заказ 5131

Тираж 594 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наф., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 высокие титры антител до 1:32-1:64, а также устойчивый напряженный иммунитет. Кроме того, данный способ по- зволяет получать вакцину без нуклеиковых кислот, являющимися источником опухолевой информации потенциаль-. но опасной в системе индуцгрования опухолей.