Способ получения сухой агглютинирующей сыворотки для диагностики вибриоза лососевых рыб

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОУХОЙ АГ-. ГЛЮТИННРУЩЕЙ СЬШОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНО- СТИКИ ВИБРИОЗА ЛОСОСЕВЫХ РЫБ в реак-ции агглютинации, включающий иммуни- , зацию кроликов-доноров путем последовательных введений культуры штамма Vibrio auguillarum с последующим тотальным обескровливанием животных, отделением сьшоротки, консервированием борной кислотой ивысушиванием препарата, отличающийся тем, что, с целью повьшения активности и стабильности сыворотки, для иммунизации кроликов-доноров используют культуру штамма Vibrio auguillarura I 7-25/1, а иммунизацию осуществляют (Л пятикратно с интервалом между инъекциями 7-8 дней в дозе 5,0; 5,0;,. 10,0; 10,0; 15,0 мпрд микробных клеток по оптическому стандарту мутности , причем первое введение проводят подкожно, а последующие - внутривенно .: О) сх to

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5D 4

Ф к

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ(СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3781662/30-15; 3751928/30-15 (22) 15.06.84 (46) 07.11.86. Бюл. 11 41 (71) Всесоюзный ордена Трудового

Красного Знамени научно-контрольный институт ветеринарных препаратов и

Всесоюзный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии (72) К. В. Шумилов, В. 3. Бондаренко, А. И. Климанов, Н. А. Томашевская, И. Д. Радин, .Т. В. Безгачина, А. И. Ыун и М. К. Кяэри (53) 597.553.2:576.858(088.8) (56) Jonsen J. $. immunological studies on Vibrioauguillarum. Aquaculture l0, 1977, 221-230 °

Banndin F. В. Lanrinsin F. В. Fish.

Vibr o Stains Anticera, in France.

Davelopmensts in biological standartizations vol. 49, ХП, 1981, 489.

„.SU„, 268172 А 1 (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОУХОЙ АГ-.

ГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНО

СТИКИ ВИБРИОЗА ЛОСОСЕВЫХ РЫБ в реакции агглютинации, включающий иммуни-, зацию кроликов-доноров путем последовательных введений культуры штамма

Vibrio auguillarum с последующим тотальным обескровливанием животных, отделением сыворотки, консервированием борной кислотой ивысушиванием .препарата, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и стабильности сыворотки.,- для им мунизации кроликов-доноров используют культуру штамма Vibrio auguillarum

7-25/1, а иммунизацию осуществляют пятикратно с интервалом между инъекциями 7-8 дней в дозе 5,0; 5,0;,.

10 0; 10,0; 15 0 млрд микробных кле- С ток по оптическому стандарту мутности, причем первое введение проводят подкожно, а последующие — внутри венно.

Ф 126

Изобретение относится к микробиологии, в частности к серологической диагностике вибриоза лососевых рыб.

Цель изобретения — повышение активности и стабильности агглютинирующей сыворотки для диагностики вибриоза лососевых рыб.

Штамм Vibrio аидид11агцш У ?-25/1 хранится в коллекции микроорганизмов

Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени государственного научноконтрольного института ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер 7-25/1.

Исходный штамм Vibriî auguillarum выделен в Эстонской CCP в 1978 r. из крови радужной форели. Иэ этого штамма путем целенаправленной селекции получен стабильный штамм Vibrio

augui1larum 7-25/1, обладающий генетически закрепленными культуральными морфологическими и биохимическими свойствами, характеризующимися следу" ющими признаками.

Культуральные и морфологические свойства.

Величина клеток односуточной агаровой культуры (1,6-2,5) х (0,41,0) мкм. Слабоиэогнутые палочки, подвижны, с одним полярно расположенным жгутиком. Спор и капсул не образует. По Граму не окрашивается.

Мясо-пептонный агар с 1,5X NaCl (рН 7,2-7,4): через 24 ч при 20С гладкие колонии, блестящие с ровным краем.

Щелочной мясо-пептонный агар (рН 8 ° 0-8,2): через 24 ч мелкие, крупные, блестящие колонии.

Дифференциально-диагностический агар с пенициллином (рН 8,0-8,2): через 24-48 ч на сине-зеленой среде выпуклые, гладкие колонии желтого цвета.

Дифференциально-диагностическая ,среда TCBS (рН 7,9-8,0): через ll824 ч на голубовато-зеленой среде плоские колонии желтого цвета.

Кровяной агар (5X бараньих эритроцитов 0,5 . NaC1): через 24 ч круглые, слизистые, полупрозрачные колонии.

Мясо-пептонный бульон с 1,5 NaC1: через 24 ч равномерное помутнение, образование нежной пленки на поверхности бульона.

Физико-биохимические признаки.

8172

Размножаются при 5-35 С. Оптимум роста 18-25 С, рН 7,2-8,2. Оптималь.ная концентрация НаС1 в питательной среде 1,5 . Разжижает желатину, гидролиэует крахмал, дает ot -гемолиэ на кровяном агаре. Реакция на оксидаэу, каталазу, тест окисления - ферментации по Хью-Лейфсону, на ацетилметилкарбинол положительная ° Восстанавли10 вает,иитраты до нитритов, сероводорода не образует, мочевину не расщеп- . ляет. Образует индол на среде с триптофаном. Ферментирует беэ образования газа арабинозу„ галактозу, декстрин, мальтозу, маннит, манноэу, сахарозу. Не ферментирует одонит, иэодульцит, лактоэу, ксилозу, инозит, рафинозу, арабиноэу. Обладает лецитиназной активностью. Положитель20 ная аргининдигидролазная реакция.

Не декарбоксилирует лизин и орнитин.

Антиге (ные свойства.

Обладает специфическим антигеном.

Агглютинируется диагностической сы25 вороткой Vibriî auguillarum, I

В качестве антигена при иммунизации кроликов используют двухсуточную культуру штамма 7-25/1 Vibrio auguillarum, выращенную на МПА с добавлени30 ем 1,5 NaCl. Культуру смывают стерильным физиологическим раствором, добавляют формалин до конечной концентрации его в суспензии 0,3 и двукратно отмывают от примесей питатель"-.

35 нои среды формалиниэированным физиологическим раствором на центрифуге при 3000 об./мин в течение 30 мин.

После последнего центрифугирования осадок культуры разводят до опреде40 ленной концентрации по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л..А.Тарасевича.

Пример l. Агглютинирующую сыворотку для диагностики вибриоза

45 лососевых рыб получали путем пятикратной гипериммунизации кроликов массой 2,0-2,5 кг, антигеном, приготовленным иэ культуры Vibrio

auguillarum 7-25/1, с интервалом

42 0 7-8 дней. Аитиген готовили с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось

10 млрд микробных клеток по оптическому стандарту мутности. Первую инъекцию кроликам проводили подкожSS но, последующие внутривенно в объемах 0,5; 0,5; 1,0; 1,0; и 1,5 мл, что соответствовало дозам 5,0; 5,01

i0,0; 10,0 и 15 млрд микробных кле3 12681 ток. На 5 день после последней инъекции антигена, у кроликов брали пробы крови и сыворотку исследовали в реакции в агглютинации с гомологичным антигеном. При постановке реакции агглютинации гипериммунную и нормальную (контроль) кроличьи сыворотки разводили формалинизированным физиологическим раствором от 1:12,5 до 1:1600. Сыворотку разливали в про- 10 бирки по 0,5 мл и. добавляли равный объем антигена, приготовленного иэ культуры штамма Vibrio auguillarum

7-25/1, с концентрацией 1 млрд микробных клеток в 1 мл. После смешивания сыворотки с антигеном получили их конечные разведения от 1:25 до

l:12800. Концентрация антигена непосредственно в пробирках составляла

500 млн жкробных клеток. После сме- 2р

Пример 4. При проверке специфичности лиофилизированной агглютинирующей гипериммунной кроличьей сыворотки для диагностики вибриоэа лососевых рыб в, реакции агглвтинации с гетерологическими антигенами (моновалентным Salmonella cholerae suis, Е. cali II 735, вибриоэным первого подвида Campylobacter fetus subspecies fetus) были получены отрицательные реакции во всех ее разведениях, при положительных реакциях с гомологичным антигеном до ее предельного тит35 ра

Предлагаемый способ получения аглютинирующей сыворотки для диагностики вибриоза лососевых рыб (пятикрат40 . ная гипериммунизация кроликов антигеном, полученным из штамма vibrio

auguillarum 7-25/1, с интервалом 78 дней в объемах 0,5; 0,5; 1,0; 1,0;

1,5 мл в pose 5,0; 5,0; 10,0; 10»0»

15,0 млрд микробных клеток по оптическому стандарту мутности) является оптимальным. Более низкие и высшие значения не позволяют получить агглютинирующую сыворотку с большей активностью и стабильностью, чем данная сыворотка.

ВНИИПИ Заказ 5955/3 . Тираж 660

Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 шивания разведени9 сыворотки с антигеном штатив с пробирками помещали в термостат при 37-38 С. Учет реакции проводили через 20 ч в крестах по четырехбальной системе..На 8 день после пятой инъекции при наличии титра антител 1:1600-1:3200 животных тотально обескровливали и получали сыворотку,, которую объединяли в одной емкости и консервировали борной кислотой. Стерильную сыворотку расфасовывали в ампулы из нейтрального стекла по 1 мл и лиофилизировали при общепринятом режиме. Высушенная сыворотка имеет форму таблетки желтоватого цвета. Титр антител составил

1:3200.

Полученная таким образом сыворотка применяется для диагностики вибриоза лососевых рыб в реакции агглю,тинацци.

Пример 2. Проводили испытание активности лиофилиэировайной агглютинирующей гипериммунной кроличьей сыворотки для диагностики внбриоза лососевых рыб в сравнении с нативной в пробирочной реакции агглютинации с гомологичным антигеном, :изготовленным из культуры штамма Vibrio auguillarum 7-25/I. Титр ан "гител в,испытуемом и исходных образцах сыворотки составил 3200 (три

72

4 креста), т.е. было установлено, что после лиофилизации активность данной сыворотки не снизилась.

Пример 3. Проводили идентификацию культур l 3, 4 и 5, выделен-, ных в Эстонской ССР при полевых условиях от радужной форели в разные годы, в перекрестной реакции агглютинации с антигеном, приготовленным из культуры Vibrio auguillarum 7-25/1.

В качестве диагностической сыворотки использовали лиофилизированную агглютинирующую гипериммунную кроличью сыворотку к штамму Vibrio

auguil1arum 7-25/l. Испытуемые и ,контрольные антигены агглютинироваг лись специфической сывороткой до ее предельного титра 1:3200, что свидельствует о принадлежности выделенных культур к виду Vibrio auguilla