Способ маркирования белка @ ферментом

 

Изобретение относится к иммунохимии , а именно к методам получения маркированного ферментной меткой белка А золотистого стафилококка, который может быть использован в твердофазных иммуноферментных методах анализа для клинической и лабораторной практики в медицине, ветеринарии. микробиологии, промышленной гигиене, криминалистике. Целью изобретения является упрощение способа и повышение удельной активности маркированного белка А. Маркирование белка А осуществляют добавлением к нему раствора фосфомоноэстеразы E.coli и антисыворотки к ферменту, что для данной партии антисыворотки соответствует условию эквивалентности. После инкубации из полученного раствора меченого белка А готовят ряд последовательных . разведений, помещают в лунки микротитрационной полистироловой панели, на стенки которых были предварительно посажены IgG человека. После инкубации несвязавшиеся комплексы удаляют промыванием физиологическим раствором, в лунки заливают раствор паранитрофенилфосфата, инкубируют, останавливают реакцию добавлением раствора NaOH. Содержимое каждой лунки спектрофотометрируют при 405 им в микрокювете. Порог чувствительности по белку А 10 нг/мл. § (Л СО а 05

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК 5п 4 G 01 N 33/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИД=ТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3893226/28-14 (22) 08.05.85 (46) 15.02.87. Бюл. № 6 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) В.С.Каплин (53) 612.015(088.8) (56) Notermans S. Timmermans P.

Wagel J., 1982, J. Immunol. Neth. 5.5, 35-4 1 (прототип).

Gutman G.À., Weissman I.Ь., 1971, J. Immunol 107, 1391. (54) СПОСОБ МАРКИРОВАНИЯ БЕЛКА А

ФЕРМЕНТОМ (57) Изобретение относится к иммунохимии, а именно к методам получения маркированного ферментной меткой белка А золотистого стафилококка, который может быть использован в твердофазных иммуноферментных методах анализа для клинической и лабораторной практики в медицине, ветеринарии, „„SU„, 1290166 А1 микробиологии, промышленной гигиене, криминалистике. Целью изобретения является упрощение способа и повышение удельной активности маркированного белка А. Маркирование белка А осуществляют добавлением к нему раствора фосфомоноэстеразы Е.coli и антисыворотки к ферменту, что для данной партии антисыворотки соответствует условию эквивалентности. После инкубации из полученного раствора меченого белка А готовят ряд последовательных . разведений, помещают в лунки микротитрационной полистироловой панели, на стенки которых были предварительно посажены IgG человека. После инкубации несвязавшиеся комплексы удаляют промыванием физиологическим раствором, в лунки заливают раствор паранитрофенилфосфата, инкубируют, останавливают реакцию добавлением раствора NaOH. Содержимое каждой лунки спектрофотометрируют при 405 нм в микрокювете. Порог чувствительности по белку А 10 нг/мл.

1290166

П р и м е. р 2. К 1 мл забуференного физиологического раствора добавляют 35 мкл культуральной жидкости, полученной после выращивания в ней золотистого стафилококка Cowan-1 и содержащей белок А в концентрации

30 мкг/мл, 5 мкл раствора фосфомоноэстеразы с концентрацией 1 мг/мл и

2 мкл антисыворотки к ферменту. Далее аналогично примеру 1. Порог чувствительности по белку А — 10 нг/мл.

Формула и з о б р е т е н и я

Составитель В. Месянжинов

Техред Л.Сердюкова Корректор Л.Пилипенко

Редактор А.Ревин

Заказ 7893/39 Тираж 798 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35,, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретение относится к иммунохимии, а именно к методам получения маркированного ферментной меткой белка А золотистого стафилококка, который может быть использован в твердофазных иммучоферментных методах анализа для клинической и .лабораторной практики в медицине, ветеринарии, микробиологии, промышленной гигиене, криминалистике и научно-исследова- 10 тельских работах биологической направленности.

Цель изобретения — упрощение способа и повышение удельной активности 15 маркированного белка А, что достигается использованием в качестве связывающего реагента антисыворотки к ферменту и проведением реакции связывания в условиях эквивалентности. 20

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Маркирование белка

А осуществляют добавлением в 1 мл физиологического раствора, забуферен- 25 ного 0,02 М трис-НС1 рН 8,0 и содержащего 1 мкг белка А, 5 мкл раствора фосфомоноэстеразы E.coli с концентрацией 1 мг/мл и 2 мкл антисыворотки к ферменту,что для данной партии анти- 30 сыворотки соответствует условию эквивалентности. После часа инкубации из полученного раствора меченого белка

А готовят ряд последовательных разведений и по 0 1 мл каждого из них помещают в лунки микротитрационной полистироловой панели, на стенки которых были предварительно посажены

ТВС человека. Инкубацию проводят 1 ч при комнатной температуре. Несвязавшиеся комплексы удаляют трехкратным промыванием физиологическим раствором. В лунки заливают по О, 1 мл раствора паранитрофенилфосфата с концентрацией 1 мг/мл на 0,1 M трис-НС! буфере рН 9,5. Через 1 ч инкубации при 37 С в лунки добавляют по 0,1 мл

0,5 M NaOH для остановки ферментативной реакции. Содержимое каждой лунки спектрофотометрируют 405 нм в микрокювете. Удельная активность меченого,белка А достаточна для выявления его в растворах с концентрацией не ниже 10 нг/мл.

Способ маркирования белка А ферментом путем их взаимодействия в условиях эквивалентности в присутствии связывающего реагента, о т л и ч а— ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения удельной активности маркированного белка А, процесс взаимодействия белка А с ферментом осуществляют в присутствии антисыворотки к используемому ферменту.