Способ выделения анионных фосфолипидов

 

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к способам получения индивидуальных фосфолипидов , может быть применено в изучении структуры и функций клеточных мембран и для приготовления липосомальных препаратов, биологически активных эмульсий, антигенных препаратов для диагностики сифилиса. Цель изобретения - повышение чистоты и выхода продукта достигается тем,что используют адсорбент, позволяющий сочетать ионообменную и афинную хроматографию и подбирают растворители для элюирования. Для этого разделяли смеси фосфолипидов из мора крупного рога . Свежий мозг гомогенизируют в-системе хлороформ - этанол (IH), остаток экстрагируют в той же системе

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (51) 4 С 07 L 9/10, G 01 N 33/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3890211/28-14 (22) 21.03.85 (46) 23.01.87. Бюл. N - 3 (71) Московский ордена Трудового Красного Знамени институт тонкой химической технологии им. M.Â. Ломоносова, Институт биологической и медицинской химии AMH СССР и Харьковский завод бактериальных препаратов (72) И.В. Межова, B.È. Швец, Б.A Êëÿ щицкий, Е.А. Шамякова, А.И. Мирошников, Г.А. Сенников и И.М. Краснополь— ский (53) 615.45(088.8) (56) Ronser G., Kritchevsky G. et а1.

Lipid composition of beef broin beef

Liver, and the sea anemone: two approaches to quantitative fractionation of complex .lipid mixtures. — J.

Amer. 0it Chemists Soc., 1963, v.40, р. 425-452. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНИОННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ (57) Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к спо-. собам получения индивидуальных фосфолипидов, может быть применено в изучении структуры и функций клеточных мембран и для приготовления липосомальных препаратов, биологически активных эмульсий, антигенных препаратов для диагностики сифилиса. Цель изобретения — повышение чистоты и выхода продукта достигается тем,что используют адсорбент, позволяющий сочетать ионообменную и афинную хроматографию и подбирают растворители для элюирования . Для этого разделяли смеси фосфолипидов из мора крупного роra. Свежий мозг гомогенизируют в-системе хлороформ — этанол (1 .1), остаток экстрагируют в той же системе (2:1). Полученный суммарный экстракт, фф содержащий фосфолипиды, адсорбируют на колонке с макропористым силикагелем, содержащим неомицил или L-лизин. Для элюирующих систем используют растворы формиата аммония в системе хлороформ — метанол — вода (1:2:0,4) Ь3 или систему, содержащую хлороформ— метанол — муравьиную кислоту в сост- )ф) ношении 1:2 ° ЯР

1284981 2

Изобретение относится к химии природных соединений, конкретно к способам получения индивидуальных фосфолипидов, и может быть использовано при изучении структуры и функций клеточных мембран, а также для приготовления липосомальных препаратов, биологически активных эмульсий, антигенных препаратов для диагностики сифилиса.

Целью изобретейия является повышение чистоты и выхода продукта.

Цель достигается за счет используемого адсорбента позволяющего сочетать элементы афинной и ионообменной хроматографии, и подбора систем растворителей для элюирования.

П р и и е р. 1. Разделение смеси фосфолипидов из мозга крупного рогатого скота.

Свежий мозг (10 r) гомогенизируют в 200 мл системы хлороформ-метанол (1:1), а остаток повторно экстрагируют 200 мл системы хлороформ — метанол (2:1). Полученный суммарный экстракт, содержащий 0,45 г фосфолипидов, наносят на колонку с,макропористым силикагелем МПС-1000-ВГХ, содержащим неомицин, присоединенный известным способом. Объем адсорбента 20 мл.

Для приготовления элюирующих систем используют растворы формиата аммония в системе хлороформ — метанол — вода (1:2:0,4).

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 60 мл системы хлороформ — метанол (1:.1).

Полученная фракция содержит 0,181 г нейтральных липидов, Затем через колонку пропускают 60 мл системы хлороформ — метанол (1:2). Полученная фракция содержит следы нейтральных липидов, а также 0,146 г смеси фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина. После этого колонку промывают

120 мл системы хлороформ — метанол— муравьиная кислота (1:2:0,1). Полученная фракция содержит 0,0045 г фосфатидной кислоты, выход 99% от исходного содержания, чистота 100Х.

Затем колонку промывают 120 мл системы хлороформ — метанол — муравьичая кислота (1:2:0,2). Полученная фракция содержит 0,081 г фосфатидилсерина, выход 99Х от исходного содержания, чистота 100%. Далее колонку промывают 40 мл системы хлороформ — метанол — вода (1: 2: О, 4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты, затем 120 мл 0,02 M раствора формиата аммония. Полученная фракция содержит 0,0225 г монофосфоинозитида, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%. После .этого через колонку пропускают 120 мл

О,! М раствора формиата аммония. По10 лученная фракция содержит 0,0034 r кардиолипина, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%. Далее через колонку пропускают 120 мл 0,4 М раствора формиата аммония. Получен1> ная фракция содержит 0,0032 г дифосфоинозитида, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%. В заключение колонку промывают 120 мл 1 М раствора формиата аммония. Получен20 ная фракция содержит 0,0034 г трифосфоинозитида, выход 99Х от исходного содержания, чистота 100Х.

Пример 2. Разделение смеси моно-, ди- и трифосфоинозитидов, выделенных из мозга крыс.

Образцы моно-, ди- и трифосфоинозитидов растворяют в 10 мл системы хлороформ — метанол (1:1) и полученный раствор, содержащий 0,09 г суммарных фосфолипидов, наносят на колонку с макропористым силикагелем

MIIC — 1000-ВГХ, содержащим неомицин, присоединенный известным способом. Объем адсорбента 5 мл.

Для приготовления элюирующих систем используют растворы формиата аммония в системе хлороформ — метанол— вода (1:2:0,4).

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 15 мл системы хлороформ — метанол (1:1) для удаления следов нейтральных липидов, фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина и 15 мл системы хлороформ — метанол — муравьиная кислота (1:2:0,05) для удаления следов фосфатидной кислоты и фосфатидилсерина.

Далее колонку промывали 10 мл системы хлороформ — метанол — вода (1:2:

:0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты, затем 30 мл

0,01 М раствора формиата аммония. Полученная фракция содержит 0,03 г монофосфозитида, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%. Затем колонку промывали 30 мл 0,4 М раствора формиата аммония. Полученная фракция содержит 0,029 r дифосфоино3 12849 зитида, выход 99% от исходного, чистота 100%. В заключение колонку промывают 30 мл 1 M фосфора формиата аммония. Полученная фракция содержит

0,03 г трифосфоинозитида, выход 99% от исходного, чистота 100%.

Пример 3. Вьделение монофосфоинозитида из пекарских дрожжей.

Суммарный липидный хлороформно-метанольный (1:1) экстракт, содержащий около 0,5 г липидов, полученный из пекарских дрожжей известным способом, наносят на колойкч с макропористым силикагелем ИПС вЂ” 1000-ВГХ, содержащим неомицин, присоединенный из- 15 вестным способом. Объем адсорбента

5 мл.

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают по 30 мп системы хлороформ — метанол (1:1) и

30 мл системы хлороформ — метанол (1:2). Полученные фракции содержат

0,44 г нейтральных и цвиттерионных липидов (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и их лизопроизводные).

После этого колонку промывают 30 мл системы хлороформ — метанол — муравьиная кислота (И 2:О, 2}, получая

0,01 r фосфатидилсерина. Затем колонку промывают 10 мл системы хлороформ — 30 метанол — вода (1:2:0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мл 0,01 М раствора формиата аммония в системе хлороформ — метанол — вода (1:2:0,4). 35

Полученная фракция содержит 0,05 г монофосфоинозитида, выход 99Х от исходного содержания, чистота 100%.

Пример 4. Выделение кардиолипина из сердечной мьппцы крупного

40 рогатого скота.

Сердечную мышцу (80 r) гомогенизируют с 600 мл ацетона, а остаток дважды экстрагируют 600 мл метанола.

Метанольный экстракт, содержащий

0,4 г суммарных фосфолипидов, упаривают, остаток растворяют в системе хлороформ — метанол (1: 1 }, отфильтровывают и наносят на колонку со сфероном P-300 (оксиэтилметакрилатный гель); содержащим неомицин, присоединенный известным способом. Объем адсорбента 5 мл.

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 30 мл смеси хлороформ — метанол (1:1) и

30 мл смеси хлороформ — метанол (i:2), вымывая фракции, содержащие,нейтраль8I 4 ные и цвиттерионные липиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и их лизопроизводные). После этого 30 мл, смеси хлороформ — метанол — муравьиная кислота (I:2:0,2) вымывают фосфатидилсерин. Затем колонку промывают 10 мл системы хлороформ — метанол— вода (1:2:0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мл 0,05 М раствора формиата аммония в системе хлороформ— метанол — вода (1:2:0,4). Полученная фракция содержит 0,033 r кардиолипина, выход 99%, чистота 100Х.

Пример 5. Вьделение кардиолипина из сердечной мышцы крупного рогатого скота.

Раствор суммарных фосфолипидов сердечной мышцы в системе хлороформ— метанол (1:!), полученный как описано в примере 4, наносят на колонку с макропористым силикагелем МПС1000-ВГХ, содержащим L-лизин, присоединенный известным способом. Объем адсорбента 5 мл. После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 30 мп системы хлороформ — метанол (1:I) и 30 мл системы хлороформ — метанол (,1:2). Полученные фракции .содержат нейтральные и цвиттерионные фосфолипиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и их лизопроизводные).

После этого системой хлороформ — метанол — муравьиная кислота (1:2:0,2) вымывают фракцию, содержащую фосфатидилсерин. Затем колонку промывают

10 мл системы хлороформ — метанол— вода-(1:2:0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мл 0,02 М раствора формиата аммония в системе хлороформ— метанол — вода (I:2:0,4) . Полученная фракция содержит 0,033 r кардиолипина, выход 99Х, чистота 100%.

Пример б. Вьделение кардиолипина из сердечной мышцы крупного рогатого скота.

Раствор суммарных фосфолипидов сердечной мьшды в системе хлороформ» метанол (1:1}, полученный как описано в примере 4, наносят на колонку с аминосилохромом 350/80. Объем адсорбента 5 мл.

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 30 мл системы хлороформ — метанол (1:1) и

30 мл системы хлороформ — метанол

128498

1 6 с ного содержания в ткани, чистота

90Х. формула изобретения

Составитель А. Переверзева

Редактор Н. Гунько Техред А.Кравчук Корректор С. Шекмар

Заказ 7557/26 Тираж 347 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 (1:2). Полученные фракции содержат нейтральные и цвиттерионные липиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и их лизопроизводные). После этого 30 мл системы хлороформ — ме- 5 танол — муравьиная кислота (1:2:0,2) вымывают фосфатидилсерин. Затем колонку промывают 10 мл системы хлороформ — метанолвода (1:2:0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мл

О,l М раствора формиата аммония в системе хлороформ — метанол — вода (1:2:0,4). Полученная Фракция содержит 0,033 г кардиолипина, выход 99

f5 от исходного содержания, чистота

100Х.

Предлагаемый способ позволяет вы— делить из сложных сйесей фосфолипидов за одну: ст дию индивиду ь- 20 ные анионные фосфолипиды с выходом

99 и чистотой 100, тогда как по известному способу выход анионных фосфолипидов составляет 90 от исходl

Способ выделения анионных фосфолипидов путем хроматографирования экстрактов природного сырья на твердых носителях с использованием для элюирования систем на основе хлороформа и метанола, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода и чистоты продукта, экстракт, содержащий смесь фосфолипидов, наносят на колонку с аминосилохромом или макропористым силикагелем, модифицированным неомицином или L-лизином, а элюацию осуществляют системой„ содержащей хлороформ — метанол — муравьиную кислоту в объемном соотношении 1:2:(0,05-0,2), или системой, содержащей 0,01 — 1 М раствор формиата аммония в смеси растворителей хлороформ — метанол — вода в объемном соотношении 1:2:0,4.