Способ определения концентрации живых микроорганизмов

 

Изобретение относится к микробиологии , а именно к анализу деионизованной воды на содержание микроорганизмов , и может быть использовано в электронной промышленности. Целью изобретения является повышение точности определения концентрации микроорганизмов . Способ основан на том, что люминесцентный краситель не проникает в живую клетку из-за барьерных свойств клеточной мембраны. При добавлении красителя к суспензии клеток он окрашивает только мертвые клетки , число которых подсчитывают в качестве фона. Затем к суспензии добав-- ляют органический растворитель, делающий мембрану проницаемой для красителя , при этом дополнительно окрашиваются живые клетки, а затем подсчитывают общее число живых и мертвых клеток. Вычитая из второго результата первый, определяют число живых микроорганизмов. 1 з.п. ф-лы, 1 табл. (Л 00 о (35 (Х

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ДВТОРСН0МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3937455/28-13 (22) 24.07.85 (46) 30.04.87. Бюл. Н 16 (72) В.С.Банников, С.М.Безручко, С.М.Кузьмин, С.В,Кузьмин, О.В.Степанищев и Н.В.Чайка (53) 663. 18(088.8) (56) Карнаухов В. Н ° Люминесцентный спектральный анализ клетки. M.:

Наука, 1978.

Hutter К.I. Biophysics System

GmbH, Im Eichenbohl 24, 6140, Bensheim Germany. Advances in Determination of Cell Viability. — Journal

of General Microbiology, 107, 1978, р. 165-167. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ

ЖИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к анализу деиониIS)) 4 С 12 N 1/00 С 12 1/06 зованной воды на содержание микроорганизмов, и может быть использовано в электронной промышленности. Целью изобретения является повышение точности определения концентрации микроорганизмов. Способ основан на том, что люминесцентный краситель не проникает в живую клетку из-за барьерных свойств клеточной мембраны. При добавлении красителя к суспензии клеток он окрашивает только мертвые клетки, число которых подсчитывают в качестве фона ° Затем к суспензии добавляют органический растворитель, делающий мембрану проницаемой для красителя, при этом дополнительно окрашиваются живые клетки, а затем подсчитывают общее число живых и мертвых клеток. Вычитая из второго результата первый, определяют число живых микроорганизмов. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

13069

Изобретение относится к микробиологии, а именно к анализу деионизованной воды на содержание микроорганизмов, и может быть использовано в электронной промышленности.

Цель изобретения является повышение точности определения концентрации микроорганизмов в деионизованной воде.

Способ определения концентрации 10 живых микроорганизмов заключается в определении разности между общим числом клеток и числом мертвых клеток, основанном на селективном окрашивании мертвых клеток флуоресцирующим красителем, предусматривающим добавление к исследуемой суспензии клеток красителя, образующего с внутриклеточными компонентами флуоресцирующий комплекс, не способный проникать че- 20 рез неповрежденную клеточную мембрану, подсчете флуоресцирующих частиц, причем после указанного подсчета к суспензии клеток добавляют ор25 ганический растворитель, нарушающии барьерные свойства мембраны клеток по отношению к флуоресцентному красителю и вновь подсчитывают число флуоресцирующих частиц. Прирост их числа в результате добавления органического растворителя принимают за число жизнеспособных микроорганизмов.

Способ основан на том, то люмилесцентный краситель не проникает в живую клетку иэ-за барьерных свойств клеточной мембраны. При добавлении красителя к суспвнзии клеток он окрашивает только мертвые клетки, число которых подсчитывают в качестве. фона. 40

Затем к суспензии добавляют органический растворитель, делающий мембрану проницаемой для красителя, при этом дополнительно окрашиваются живые клетки, а затем подсчитывают общее 45 число живых и мертвых. Вычитая из второго результата первый, определяют число живых микроорганизмов.

Таким образом, при подсчете определяется фон: число мертвых микроорганизмов и частиц, обладающих по какой-либо причине собственйой характерной люминесценцией. При втором подсчете к ним добавляется число живых микроорганизмов, прокрасившихся элагодаря добавлению вещества, дей"твующего. на мембрану. Вычитая первый

"чет из второго, вычитают фон. Это

47 2 обстоятельство повышает чувствительность и точность способа.

Известно (1), что мембраны живых клеток непроницаемы для большинства цитологических красителей. Поэтому в большинстве цитологических методик окрашиванию предшествует операция фиксации, заключающаяся в обработке клеток кислотами и спиртами. Такая обработка разрушает мембрану и краситель окрашивает внутриклеточные компоненты. Фиксацию для рассматриваемой цели проводить нецелесообразно, так как, кроме тогс, что добавляется ряд операций, все клетки посл фиксации оказываются мертвыми и зопрос об определении живых не стоит. Окрасить клетки можно и непосредственно в анализируемом растворе, сделав мембрану проницаемой для красителя. Такой способ и вещества известны в лабораторной практике: для сохранения растворов от зарастания к ним обычно добавляют каплю толуола или хлороформа, микроорганизмы при этом погибают именно из-за повреждения данными растворителями мембран.

Для окрашивания клеток испытали указанные вещества. Окрашивание про1 исходит, однако следы толуола и хлороформа вызывают значительное тушение люминесценции,, для ликвидации которого прооу нужно дополнительно нагреть, чтобы испарить эти вещества.

Поэтому хотя применение толуола и хлороформа для окрашивания возможно, но неудобно. Бензол не вызывает тушения люминесценции, поэтому он удобней.

Сделать мембрану про ицаемой дпя красителя можно, добавив к пробе примерно 10 М этилендиамин-тетраазетата

-5 (ЭДТА), который связывает ионы кальция и магния и тем самым разрушает структуру мембранных белков.

Пример 1. Пробы деионизованной воды объемом 100 мл отбирают в разных точках технологических гстановок: пробы 1-3 после фильтров .онкой очистки, проба 4 до фильтра, причем после промывки установки 37-ной перекисью водорода с целью стерилизации.

К каждой пробе добавляют rio 0,1 мл водного раствора этидиум бромида (0,2 мг/мл). Каждую пробу разделяют пополам, к вторым половинам добавляют по 1-2 капли бензола, тщательно встряхивают и оставляют обе половины стоять 1 ч. Пробы фильтруют через мем1306947 дг

С=п

Таким образом, т в) n=8 > а) концентрация частиц

С=, V

50 где Q

V число частиц; объем пробы.

-,С1г

Q— = n S=n

4 б) 55 г г ч=--4 бранные фильтры для люминесцентной микроскопии. Сканируя фильтр под люминесцентным микроскопом в красной области, подсчитывают число флуоресци— рующих частиц. Каждую частицу иденти- 5 фицируют визуально по морфологическим признакам, при необходимости переходя на большее увеличение. Концентрацию частиц подсчитывают по формуле

;;дг 1 10

С=2 4 D где N — подсчитанное число частиц; — 100 мм — длина. сканирования;

D, = 1,6 мм (об.х10) — диаметр поля зрения объектива; с1 = 17 мм — диаметр зоны фильтрации на фильтре;

V = 50 мп — объем пробы.

После подстановки указанных значений формула для определения концентрации приобретает вид

С = 0,028N.

Поскольку источником погрешности определения является малость числа И и то, что измерение проводят один раз, само число определяют со средней квадратичной погрешностью +1Г (21. ПоэтоJ му погрешность определения концентрации микроорганизмов следующая:

FC = 0,О28- И,,г

Б таблице даны примеры подсчета по видам микроорганизмов, их концент35 рации в первой (С<) и второй пробах (С ) и концентрации живых микро2 огранизмов (С -С ).

Зависимость, представленная в формуле определения концентрации флуоресцирующих частиц, выведена впервые, носит частный характер — подсчет частиц на фильтре под микроскопом — и касается конкретного примера осуществления предлагаемого способа, кроме того, она очевидна. где п — плотность расположения частиц на фильтре; площадь фильтрации; диаметр зоны фильтрации. где И вЂ” число сосчитанных частиц;

S — площадь сканирования.

N cl2 1

Таким образом C=S 4 г) S=P. D где l — длина сканирования;

D, — диаметр поля зрения объектива.

NЯ 1

Таким образом,С=-. —,---т 0 V

Для сравнения чувствительности и точности прототипа и предлагаемого способа рассматривают анализ деионизованной воды, загрязнения в которой установлены другими независимыми способами.

Деионизованная вода высшей очистки марки "А" содержит, мл

Частицы (с ) ) 0,5 мкм До 300

Живые микроорганизмы (Ж м/о) Примерно 1

Мертвые микроорганизмы (M м/о) Примерно 1

Флуоресцируюшие частицы (фч) 0,5

Определение по известному способу.

I é подсчет Ж м/о+М м/о + сч =1+ 1+

+300=302 мл

II-й подсчет М м/о+фч=1+0,5=

=1,5 мл

I-II=302-1,5 = 300 мл т.е. для принятых условий погрешность определения составляет (300 1) 100 - 30 007

1 о

Определение по предлагаемому способу.

I-й подсчет М м/о+фч= 1+0,5=

=1,5 мл .

II-подсчет Ж м/о+М м/о+фч=2,5 мл

II-I=2,5 — 1,5=1 мл

Этот анализ сделан без учета статистических погрешностей, Реальные погрешности для определений по предлагаемому способу приведены в таблице .

Ф о р м у л а и s о б р е т е н и я

1. Способ определения концентрации живых микроорганизмов, предусматривающий добавление к суспензии микроорганизмов красителя, образующего с внутриклеточными компонентами флуоресцирующий комплекс, не способный про1306947 (с с,) B

0.0

Грибы

О.О6

Дрожжи

0.1

0.2

Бактерии

0.6

2.0

0.0

Кокки

О.з

Флуоресцирующие частицы

О.з

Всего:

2.8 0.3 1.9+0.4

Грибы

0.1

0.0

Дрожжи

0.2

Бактерии

0.8 120

0.3 12

3.4

Кокки

0.3

Флуоресцирующие частицы

0.0

0.03

Всего .

3 „7+ О . 3 2 . 6+ 0. 4

3 Грибы

0Ä08

Дрожжи

0Ä6

Бактерии

1.0

2.0

Кокки

0.0

0.0

0.0

Флуоресцирующие частицы

0.3 6

1. 7+0.2 99

0.2

Всего:

2.8+0.3 1.1+0.4

4 Грибы

26

186

170

Дрожжи

635

Бактерии

686 никать в клетку через неповрежденную мембрану, подсчет QKpBttfe HHhlx частиц, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения микроорганизмов в деионизованной воде, после подсчета окрашенных частиц к суспензии клеток добавляют органический растворитель, вновь подсчиПроба, Вид микроорганизма N

М- тывают число окрашенных частиц, а концентрацию живых микроорганизмов определяют по разности между вторым и первым подсчетами.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве органического растворителя используют бензол или толуол, или хлороформ.

0,2 10

0.9"0.2 99

0.0 4

1.1+0.2 133

0.03 3

0.4 20

1306947

Продолжение таблицы

С+8, Вид микроорганизма N, Проба, У

140

i6i

Кокки

Флуоресцирующие частицы

48

1035

2+0.9 1091

Всего:

3+0. 9 1+ 1. 3

Составитель Л.Борисова

Редактор М.Бандура Техред А.Кравчук Корректор М.Демчик

Заказ 1497/23 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Óæãoðîä, ул.Проектная, 4 !

")