Способ получения @ - и @ -субъединиц из лютенизирующего гормона

 

Изобретение касается получения природных веществ, в частности об и р-субъединиц (СЕ) из лютенизирующего гормона, которые используют в биологии , медицине и фармацевтической промьшшенности. Цель - повьшение выхода СЕ и упрощение процесса. Последний ведут пропусканием раствора лютенизирующего гормона из кашалота или быка в другой смеси растворителей при объемном соотношении н-бутанола, воды и СН,СООН (50-60):(25-30):(15- 20) через колонку с сорбирующей насадкой , в качестве которой используют сефадекс С-25 при загрузке гормона 1-2 мг на 1 мл сорбента. Элюирование проводят ступенчато, т.е. вымьшают -субъединицу указанной смесью растворителей (лучше при объемном соотношении 10:5:3), а затем oi-субъединицу , но с другим соотношением растворителей , т.е. (0-35);(50-65):(15- 35), преимущественно 2:4:1. Затем полученные растворы упаривают, лиофилизируют и проводят гельфильтрацию на сефадексе G-100 фракции, содержащей oi -субъединицу. Способ обеспечивает увеличение выхода с 75 до 96% и позволяет упростить процесс за счет сокращения стадий обессоливания и гельфильтрации при исключении использования мочевины и гуанидинхлорида, которые содержат примеси, снижающие биологическую ценность белков. 2 з.п. ф-лы, 1 табл. & (Л io 4 о со

СОЮЗ СОВЕ ГСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) (51) 4 С 07 К 13/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ д "

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ и,. - (21) 3953858/31-04 (22) 16.09.85 (46) 15.05.87. Бюл. № 18 (71) Институт экспериментальной эндокринологии и химии гормонов

AMH СССР (72) Ю.А.Панков и В.С.Карасев (53) 547.964.4.07 (088.8) (56) Hennen G., Prusik Z., Maghuin G. — Rogister Porcine Luteinizing Hormone and its Subunits.

Isolation and characterization Eur. . J.Biochem. 1971, 18, 376-383. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ к- и -СУБЪЕДИНИЦ ИЗ Л10ТЕНИЗИРУ)ОЩЕГО ГОРМОНА (57) Изобретение касается получения природных веществ, в частности О(,- и

Р-субъединиц (СЕ) из лютенизирующего гормона, которые используют в биологии, медицине и фармацевтической промьппленности. Цель — повьппение выхода СЕ и упрощение процесса. Последний ведут пропусканием раствора лютенизирующего гормона из кашалота или быка в другой смеси растворителей при объемном соотношении н-бутанола, воды и СН СООН (50-60):(25-30):(1520) через колонку с сорбирующей насадкой, в качестве которой используют сефадекс С-25 при загрузке гориона 1-2 мг на 1 мл сорбента. Элюирование проводят ступенчато, т.е. вымывают 8-субъеднницу указанной смесью растворителей (лучше при объемном соотношении 10:5:3), а затем ы-субъединицу, но с другим соотношением растворителей, т. е. (0-35);- (50-65): (153"), преимущественно 2: 4: 1. Затем полученные растворы упаривают, лиофилизируют и проводят гельфильтрацию на сефадексе G-100 фракции, содержащей (-субъединицу. Способ обеспечивает увеличение выхода с 75 до 967. и позволяет упростить процесс за счет сокращения стадий обессоливания и гельфильтрации при исключении использования мочевины и гуанидинхлорида, которые содержат примеси, снижающие биологическую ценность белков.

2 s.n. ф-лы, 1 табл.! 13

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения — и ф -субъединиц из лютенизирующего гормона и может найти применение в биологии, медицине, фармацевтической промышленности.

Цель изобретения — упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта.

Предлагаемый способ благодаря использованию в качестве сорбирующей насадки сефадекса G-25 и ступенчатого градиента при элюции вначале системой н-бутанол — вода — уксусная кислота, в объемных процентах 50-60:

:25-30:15-20 для вымывания В -субъединиц, а затем системой н-бутанол— вода — уксусная кислота, в объемных процентах 0-35:50-65:15-35 для вымывания М,-субъединиц, позволяет повысить выход целевых продуктов до 96, вместо 75 в известном способе, а также упростить процесс, сократив количество стадий (обессоливакие и гель-фильтрацию) и исключив использование мочевины или гуаницинхлорида, которые к тому же содержат примеси, снижающие биологическую активность белка.

Пример 1. 500 мг ЛГ кашалота растворяют в 50 мл системы, содержащей н-бутанол, воду и уксусную кислоту в объемном соотношении 10:5:3-„ в об.% 50-60:25-30:15-20. Раствор белка вносят в колонку с сефадексом

С-25 тонкий (3,6 25 см), уравновешенную той же системой (нагрузка 1-2 мг белка на 1 мл), скорость элюции 101

20.мг/см ч. После выхода первого пика, содержащего 6-субъединицу колонку отмывают до исчезновения белка в элюате и дальнейшую елюцию проводят системой с объемным соотношением компонентов н-бутанол — вода — уксусная кислота 2:4:1, в об. 0 — 35:50-65:1535. Скорость элюции 120 мл/ч. Первый и второй пики собирают раздельно и упаривают на роторном испарителе в о вакууме при 35 С до 1/10 исходного объема. Полученные фракции разбавляют водой и лиофилизируют. Материалы второго пика подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом С-100 в 0,05 М аммоний бикарбонатном буфере. В результате гельфильтрации получают два. пика. Первый пик — белковые примеси (не ЛГ), второи пик содержит ci,-субъедикицу. Фракции объединяют и лиофилизируют. Выход р-cóáü10403 2 единицы 240 мг, с -субъединицы 220 мг, примесные белки 20 мг. Таким образом, выход субъединиц с учетом примесей

96%.

Приме р 2. 500 мг ЛГ минке обрабатывают аналогично примеру 1.

В .ход Р-субъединицы ЛГ 215 мг, Ы субъединицы ЛГ 220 мг и примесные белки 21 мг (87 ).

II р и м е р 3. 100 мг ЛГ быка обрабатывают, как в примере 1, кроме следующих измерений: белок растворяют в 12 мл исходной трехкомпонентной системы к-бутанол — вода — уксусная кислота 10;5:3. Размер колонки с сефадексом С-25 (2,5 15 см). Выход<4 —, субъединицы 42 мг, Р -субъединицы

43 мг, примесные белки 6 мг.

Пример 4. 50 мг ЛГ кашалота растворяют в 25 мл системы н-бутанолвода — уксусная кислота 13:4:4 и пропускают через колонку с сефадексом

С-25 объемом 50 мл. Вторая система элюции и прочие условия аналогичны примеру !. Выход Р-субъединицы 15 мг, ж-субъединицы 18 мг.

Пример 5. 50 мг ЛГ кашалота растворяют в 5 мл системы н-бутаног— вода — уксусная кислота 10:5:3 и пропускают через колонку с сефадексом

G-25 объемом 30 мл.х -Субъединицу деаорбируют системой с соотношением компонентов к-бутакол — вода — уксусная кислота 3:3:2,, Остальные условия подобны примеру 1, Выход -субъединицы 13 мг, f -субъедикицы 22 мг.

Замена сефадекса в качестве сорбента ка целлюлозу приводит к уменьшению отношения белок/объем сорбента, а также к замедлению процесса изза большего сопрогивлекия току элюента колонок с целлюлозой.

Пример 6. Для разделения

100 мл ЛГ кашалота на субъединицы используют колонку с целлюлозой (3,6"

"25 см), скорость злюции 30 мл/ч, при прочих условиях одинаковых спримером 1. ВыходМ -субъединицы 35 мг,,3-субъединицы 38 мг.

Критерием частоты, полученных препаратов М- и (-субъедикиц является их аминокислоткый состав. В таблице приведены данные по аминокислотному составу Ж- и 9 -субъединиц ЛГ из гипофизов быка и кита кашалота, полученные при определении аминокислотного состава и аминокислотной последовательности.

3 13104

Из таблицы видно, что аминокислот ный состав субъединиц, полученных предлагаемым и известным способами, практически совпадает.

Предлагаемый в данном способе интервал нагрузок по белку обусловлен следующим. Увеличение (2 мг/мл) соотношения белок/сорбент будет приводить к проскокусБ-субъединицы во фракцию Р -субъединицы. Чрезмерное умень- f0 шение (1 мг/мл) соотношения белок/сор бент приведет к замедлению процесса и увеличению объема фракций, в которые входят Ж вЂ” и Р-субъединицы.

Процесс элюирования фракций М, — и 15

1-субъединиц контролируют с помощью

УФ-детектора при 280 нм, объем элюированных фракций pL — и Р-субъединиц не превышает обычно удвоенного объема нанесения. 20

Поскольку сефадексы — сорбенты не приспособленные к работе с противо1 давлением, то обычно используется естественная текучесть колонки с сефадексом. Искусственное замедление процесса элюции приводит к уменьшению объема фракций элюирующихсясБ— и 8 -субъединиц до 1,3 — 1,5 объема нанесения, но одновременно увеличивается время разделения. Естествен- 30 .ная текучесть колонки длиной 20 см, заполненной сефадексом G-25 (тонкий) в пределах 10-20 мл/см ч, Для элюирования используют систе35 мы растворителей из н-бутанола — воды — уксусной кислоты. Для первой системы с интервалом для н-бутанола

50-607, для воды 25-30, а для уксусной кислоты 15-207.. Снижение для 0 этой системы содержания бутанола до

507. и ниже, а также увеличение содержания уксусной кислоты до 207 и выше приводит в целом к уменьшению сорбционных свойств сефадекса по от- 45 ношению ко -субъединице. Это влечет за собой снижение нагрузочной емкос ти колонки с сефадексом, а еще большее снижение концентрации бутанола или (и) увеличения концентрации уксусной кислоты приводит в конце концов к проскоку oC— - субъединицы во фракцию

8-субъединицы. Снижение (в первой системе) содержания воды до 15Х и ниже приводит к снижению растворимос-55 ти белка в первой системе, а увеличение содержания воды до 207. и выше влечет за собой увеличение содержания уксусной кислоты (обусловлено

03 4 условием смешиваемости системы) и как следствие к увеличению вероятности проскока п4 -субъединицы во фракцию

В-субъединицы.

Состав второй системы допускает большие вариации содержания компонентов. Основные требования предъявляемые к ней: хорошая растворимость в нейп -субъединицы, хорошая смешива. емость с первой системой и отсутствие сорбционных взаимодействий между сефадексом и -субъединицей в этой системе.

Снижение во второй системе содержания н-бутанола вплоть до ОХ влечет увеличение содержания уксусной кислоты до 35Х. В целом смешиваемость первой и второй систем лучше, когда обе системы содержат н-бутанол. кроме того повьш.ение содержания уксус—

У ной кислоты — это более жесткие нежелательные условия для белка. Содержание воды во второй системе целиком определяется приведенными вьппе тремя требованиями.

Формула изобре тенин.

1. Способ получения — и В -субъе/ диниц из лютенизирующего гормона, включающий пропускание раствора лютенизирующего гормона в смеси растворителей через колонку с сорбирующей насадкой, элюирование растворителем переменного состава, последующее упаривание, лиофилизацию и гельфильтрацию на сефадексе G-100 фракции, содержащей сС -субъединицу, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и повьппения выхода, в качестве сорбирующей насадки используют сефадекс С-25, в качестве растворителя — смесь н-бутанол — вода — уксусная кислота при соотношении, об.7.: 50-60:25-30:15-20 при загрузке гормона из расчета 12 мг на 2 мл сорбента, а элюирование проводят ступенчато с использованием вначале указанной смес. растворителей до полного вымывания р -субъединицы, затем элюирование проводят смесью н-бутанол — вода — уксусная кислота при соотношении 0-35:50-65:15-35, об. .

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что состав элюента первой ступени н-бутанол — вода — уксусная кислота 10:5:3, об.7..

1310403

6 второй ступени н-бутанол — вода — ук, сусная кислота 2 4:1, об.%.

P -ËÃ кашалота оа -ЛГ кашалота Амино- кисло(3-ЛГ быка

ot -ЛГ быка

Последовательность ослеПоследоПоследовательта + довательность

+v вательность ность

6,3 5,8 6

9,0 8,5 9

5,4 5,8 6

7,9 8,4 8

7,5 6,8 7

4,3 4,8 4

7 0 7 3 7

Асп

Тре

Сер

Глу

Про

Гли

1/2Цис 9,2 8,5 10

5,4 5,2 5

3,7 3,7 4

2,0 1,9 2

1,9 1,8 2

Мет

2,2

2,2

2 3,9 3,8 4

3 i0,4 10,5 11

5 2,2 2,2 2

537353.

3 0,9 0,9 1

3,6

Лей

4,9 5,1

4,9 5,2

3,0 2,8

10,1 10,2 .3,8 3,6 5,0

5,0 5

Тир

4,9 5,2 5

2,9 3,2 3

10,2 10,3 10

3,0 3,2 3

Фен

Гис

3 10,8 11,1 11

Apr

Аминокислотный состав субъединиц, полученных известными методами.

**

Аминокислотный состав субъединиц, полученных предлагаемым методом.

Составитель В.Волкова

ТехРеД H.Глушенко КоРРектоР И.ЭРДейи

Редактор И.Сегляник

Заказ 1865/24

Тираж 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород,ул.Проектная,4

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что состав элюента

53 54 5

6,9 6,8 7

7,3 7,8 8

6,0 6,2 6

19,6 20,3 20

6,7 7,3 7

8,2 7,8 8

10,0 10,4 12

8,0 8,2 8

2,4 2,7 3

4,4 4,9 5

11,5 11 9 12

2,0 2,2 2

393 ЗРЗ 3

28273

22 1,8 2

8,0 8,3 8

5 1 5,2

8,4 7,9

6,1 5,8

7,9 8,2

6,4 6,1

5,2 5,1

8>3 7>8

8,6 8,5

4,2 4,1

3,6 3,7

5 5,7 5,4 5

8 5;О 4,9 5

6 9,0 8,9 9

8 5,3 5,3 5

6 20,8 20,9 21

5 8,2 8,1 8

8 11,1 10 9 11

10 10, 2 10,5 12

4 83 81 8

4 1,9 1,8 2