Способ получения компонентов а @ ,а @ ,а @ ,а @ ,в @ или в @ антибиотического комплекса ввм-1675 , обладающих антимикробным и противоопухолевым действием, штамм актиномицета астinомаdurа verrucosospora атсс 39334 и штамм актиномицета астinомаdurа verrucosospora атсс 39638, используемый для получения компонентов а @ ,а @ ,а @ ,а @ , в @ или в @ антибиотического комплекса ввм-1675 , обладающих антимикробным и противоопухолевым действием

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения антибиотического комплекса ВВМ-1675 и его компонентов А.А, Aj , А , By и В , а также новых штаммов-продуцентов антибиотиков Actinomadura verrucoso- spora АТСС 39334 и его мутанта АТСС 39638. Цель изобретения - изыскание новых штаммов-продуцентов и разработка способа получения антибиотиков, обладающих антимикробным и противоопухолевым действием. Штамм АТСС .39334 вьщелен из пробы почвы Аргентины , а гатамм АТСС 39638 является его мутантом. Антибиотический комплекс получают путем культивирования одного из упомянутых штаммов в ферментационной среде, содержащей тростниковую мелассу, кукурузный крахмал, рыбную муку и минеральные соли, в течение 3-7 дней при 28 С в условиях встряхивания и перемешивания при аэрации со скоростью от 0,667 до 1,2л воздуха на 1 л ферментационной среды в 1 мин. Целевой продукт экстрагируют из мицелиальной лепешки и всплывающего слоя органическими растворителями. Экстракты объединяют , концентрируют и полуочшценный комплекс подвергают хроматографическому разделению для получения компонентов AY jAj. ,АЗ jA , В и B;j-. Компоненты элюируют в градиенте метанола в хлороформе, активные фракции каждого компонента объединяют, концентрируют , перекристаллизовьшают и выделяют чистые продукты. Антибиотики обладают широким антимикробным действием , индуцируют профаг в лизогенных бактериях, антибиотические компоненты группы А обладают противоопухолевой активностью, ингибируя рост лейкемии, меланомы, легочной карциномы Льюиса. 2 с.п. ф-лы, 1 табл. § (У) см

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„,80„„1 4

ВСЕ(.йЮЩ g

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ И.,„, „l3

ЙИБЛНОТЕКА

К IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3744582/28-13 (22) 15.05.84 (31) 495231 (32) 16.05.83 (33) US (46) 07.10 ° 87.Бюл. У 37 (71) Бристол-Мейерз Компани (US) (72) Масатака Кониси, Киоитиро Сайтох, Хироаки Охкума и Хироси Кавагути (JP) (53) 615.779.93 (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ

А,А,А,А В ИЛИ В .АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ВВМ-1675, ОБЛАДАЮЩИХ

AHYHMHKP0BHbIN И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ

ДЕЙСТВИЕМ, ШТАММ АКТИНОМИЦЕТА ACTI

NOHA0URA VERRUC0SOSPORA АТСС 39334

И ШТАММ АКТИНОМИЦЕТА ACTI110ИАООЯА

VERRUCOS0SP0RA АТСС 39638, ИСПОЛЬЗУЕМЬЕ1 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ

А,А,АЗ,Ад,В ИЛИ В, ОБЛАДАЮЩИХ

АНТИМИКРОБНЫМ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЬ1М

ДЕЙСТВИЕМ (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается получения антибиотического комплекса BBM-1675 и его компонентов А,А,, А, А, В и В, а также новых штаммов-продуцентов антибиотиков Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 и его мутанта ATCC

39638. Цель изобретения — изыскание новых штаммов-продуцентов и разработка способа получения антибиотиков, обладающих антимикробным и противо(5D4С12P 1 06 (С12Р1 06С12R: 3 опухолевым действием. Штамм АТСС

39334 выделен из пробы почвы Аргентины, а штамм АТСС 39638 является его мутантом. Антибиотический комплекс получают путем культивирования одного из упомянутых штаммов в ферментационной среде, содержащей тростниковую мелассу, кукурузный крахмал, рыбную муку и минеральные соли, в течение 3-7 дней при 28 С в условиях встряхивания и перемешивания при аэрации со скоростью от 0,667 до

1,2 л воздуха на 1 л ферментационной среды в 1 мин. Целевой продукт экстрагируют иэ мицелиальной лепешки и всплывающего слоя органическими растворителями. Экстракты объединяют, концентрируют и полуочищенный комплекс подвергают хроматографическому разделению для получения компонентов А,А,Аз,А, В и В .. Компоненты элюируют в градиенте метанола в хлороформе. активные фракции каждого компонента объединяют, концентрируют, перекристаллизовывают и вы. деляют чистые продукты. Антибиотики обладают широким антимикробным действием, индуцируют профаг в лизогенных бактериях, антибиотические компоненты группы А обладают противоопухолевой активностью, инrибируя рост лейкемии, меланомы, легочной карциномы Льюиса. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.

1344249

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к производству антибиотиков.

Целью изобретения является выявление штаммов-продуцентов и разработка способа получения нового антибиотика, обладающего антимикробным и противоопухолевым действием.

Для осуществления способа используют штамм Actinomadura verrucoso-. зрога, который выделен из пробы почвы, собранной в Аргентине. Штамм де. понирован в Американской коллекции типовых культур под номером АТСС

39334. Иа данного штамма получен мутантный штамм, который депонирован в той же коллекции под номером

АТСС 39638.

Штамм АТСС 39334 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Образует как субстратный, так и воздушный мицелий. Субстратный мицелий - длинные, разветвленные, нефрагментированные волокна. Воздушный мицелий — короткие цепочки спор образуются моноподиально или на концах гифов; ответвления в виде завитков, цепочек спор также наблюдаются вблизи концов гифов спороносные цепочки содержат от 2 до 10 спор в цепочке прямой, извилистой или крючкообразной формы. Споры имеют бородавчатую поверхность, от сферической до эллиптической формы с округлыми или остроконечными концами размером

0,5-0,6 х 0,6-1,4 мкм. После созревания каждая спора. часто отделяется пустой оболочкой. Подвижные споры, спорангии или склеротические гранулы не видны.

Агар с триптоном и дрожжевым экстрактом (ISP Ф 1) - рост обильный, хлопьевидно-опущенный, седиментированный, непигментированный.

Среда Чапека — рост умеренный, субстратный мицелий бесцветный, воздушный мицелий скудный, слегка серый (264) до бледно-розового (7), растворимый пигмент отсутствует.

Агар с глюкозой и аспарагином— рост умеренный, субстратный мицелий белый (263) до глубокого желтовато-розового (27), воздушный мицелий отсутствует или очень скудный, бледно-розовый (7 ). Растворимый пигмент отсутствует °

Агар с глицерином и аспарагином (ISP У 5) - рост плохой до умеренного, субстратный мицелий бесцветный до слегка желтовато-розового (28), воздушный мицелий плохой, слегка желтовато-розовый (28), после 5 мес слегка голубовато-серый (190). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с неорганическими солями и крахмалом (ISP Р .4) - рост обильный, субстратный мицелий желтовато-белый

1 (92), воздушный мицелий обильный, слегка розовый (4) до розовато-серого (10). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с тирозином (ISP II 7) рост умеренный, субстратный мицелий желтовато-белый (92), воэдушньпТ мицелий плохой, слегка желтовато-розовый (28), через 5 мес частично слегка голубовато-серый (190). Растворимый пигмент отсутствует.

Питательный агар — рост плохой до умеренного.

Субстратный мицелий бледно-желтый (89), воздушный мицелий отсутствует„ растворимый пигмент отсутствует.

Агар с дрожжевым экстрактом и солодовым экстрактом (ISP Ф 2) рост обильный, субстратный мицелий бледно-желтый (89), воздушный мицелий плохой, белый (263), Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с овсяной мукой (15Р Ф 3) рост умеренный, субстратный мицелий бесцветный до бледно-розового (7), воздушный мицелий плохой, розоватобелый (9) до слегка голубого (190), растворимый пигмент отсутствует.

Агар с пептонам, дрожжевым экстрактом и железом (ISP Р 6) — рост умеренный, субстратный мицелий бесцветный, воздушный мицелий отсутствует,.растворимый пигмент отсутствует.

Культуральные признаки выявлены о после инкубирования при 37 С в течение 3-х недель.

Цвет и номер цветового стандарта: nKeliy К.L., О.В;Judd: ISCC-NBS

color-паве charts Illustrated with

Centroid colors US Dept of comm.

cir.553, Washington, D.Ñ., nov 1975.

Физиолого-биохимические свойства: о максимальный рост при 28-37 С, умео ренный при 20 и 43 С, не растет при

10 и 47 С (на агаре Беннета), рН 5,0-9,5.

1344249, 40

Желатину сжижает. Крахмал гидролизует. Снятое молоко не коагулирует., полностью пептонизирует. Меланоидный пигмент не образует. Нитраты в нитриты не восстанавливает.

Растет при концентрации NaCI 57. и менее; при 77 — рост отсутствует.

Устойчив к лизоциму — рост при

0,01Х и менее; при О,IX рост отсутствует.

Утилизирует глицерин, арабинозу, О-ксилоэу, О-рибозу, L-рамнозу, D-глюкозу, О-фруктозу, сахарозу, целлобиозу, трегалозу, крахмал, целлюлозу, инозит, О-маннит; не утилизирует D(-)-арабинозу, D-галактозу, О-маннозу, L (-)-сорбозу, лактозу, мелибиозу, раффинозу, 0 (+) -мелитозу, дуль ;ит, О-сорбит,салицин.

Наблюдения после инкубирования при 28 С в течение 3-х недель.

Очищенная клеточная стенка содержит мезодиаминопимелиновую кислоту, глицин отсутствует. Присутствует мадуроза, глюкоза и ритоза, главные компоненты менахинона идентифицированы как МК-9(Н; ) и МК-9(Н8) . Клеточная стенка типа Ша .

Мутантный штамм АТСС 39638 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Морфология сходна с исходным штаммом. Агар с триптоном и дрожжевым экстрактом (1ЬР У 1) - рост умеренный хлопьевидно-опущенный, седиментированный и непигментированный.

Среда Чапека — рост плохой. Субстратный мицелий бесцветный, воздушный мицелий отсутствует или скудный, розовато-белый (9), растворимый пигмент отсутствует.

Агар с глюкозой и аспарагином — рост плохой. Субстратный мицелий бесцветный, воздушный мицелий отсутствует или очень скудный, белый. Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с глицерином и аспарагином (15Р - 5) — рост умеренный. Субстратный мицелий слегка желтовато-розовый (28); воздушный мицелий умеренный белый до слегка розового (4).

Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с неорганическими солями и крахмалом (ISP 11-. 4) - рост умерен5

35 ный, субстратный мицелий желтоваторозовый (28); воздушный мицелий умеренный, слегка голубовато-серый (190), Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с тирозином (ISP II- 7) рост умеренный. Субстратный мицелий интенсивно .желтовато †розов 26; воздушный мицелий умеренный, белый, слегка розовый (4 ). Растворимый пигмент отсутствует.

Питательный агар — рост плохой.

Субстратный мицелий бесцветный до бледно-розового (7 ); воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с дрожжевым экстрактом и солодовым экстрактом (ISP Ф 2} рост обильный. Субстратный мицелий интенсивный желтовато-розовый (26); воздушный мицелий плохой, белый до бледно †розово (7). Растворимый пигмент отсутствует °

Агар с овсяной мукой (ISP В 3) рост плохой. Субстратный мицелий бледно желтовато-розовый (31); воз- душный мицелий очень скудный, ярко бледно-голубой (184) . Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с пептоном, дрожжевым экстрактом и железом (ISP Ф 6) - рост обильный. Субстратный мицелий бесцветный, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки.

Усваивает глицерин, I (+)-арабинозу, О-ксилозу, L-рамнозу, 0-глюкозу, D-фруктоэу, сахарозу, целлобиозу, трегалозу, крахмал, целлюлозу, 0-маннит; не усваивает О(-(-арабиноэу, О-рибозу, D-галактоэу, 0-маннозу, L (-(-сорбозу, лактоэу, мелибиозу, раффинозу, D(l) -мелицитозу, дульцит, инозит, D-сорбит, салицнн.

Остальные свойства аналогичны штамму АТСС 39334.

Пример 1. Штамм Actinomadura verrucosospora АТСС 39334 выращивают и поддерживают на скошенном агаре, содержащем,Ж: солодовый экстракт

1; глюкоза 0,4; дрожжевой экстракт

0,4; карбонат кальция 0,05; агар

1,6. Культуру используют для инокулирования вегетативной среды, содержащей, Ж: растворимый крахмал 3; сухие дрожжи К НР04 0,3; КН РО 0,1, гептагидрат сульфата магния 0,05;

1344249

NaC1 0,2; СаСО 0,1. рН среды до стерилизации 7,0. Посевную культуру

О выращивают при 32 С в течение 72 ч на вращающемся встряхивателе (250 об/мин); 5 мл посевного материала переносят в 500 мл колбу Эрленмейера, содержащую 100 мл. ферментационной среды, состоящей, 7: тростниковая меласса 3 кукуруз- 10 ный крахмал 1; рыбная мука 1;

СаСО> 0,1; CuSOq 5H O 0,005. рН до стерилизации 7,0. Ферментацию ведут при 28 С в течение

6 дней на вращающемся встряхивателе. 15

При проведении процесса в ферментаторах 500 мл посевного материала переносят в 20-литровые баночные ферментаторы, содержащие 10 л фермента " ционной среды. Ферментацию проводят 20 о при 32 С при скорости аэрирования

12 л/мин (т.е.1,2 л воздуха/мин/л среды) и скорости перемешивания

250 об/мин.

После 68-76 ч ферментации макси25 мум образования антибиотика

0,9 мкг/мл.

При проведении ферментации в

200-литровом ферментационном танке процесс ведут при 28" С, 164 об/мин и скорости аэрирования 0,66 л воздуха/л среды/мин. Величина рН среды постепенно поднимается в процессе ферментации и достигает 7,7-7,8 через 170-180 ч, пик антибиотической 35 активности достигает 1,7 мкг/мл.

П р, и м е р 2. Выделение и очистка антибиотического комплекса.

Полученные 3000 л культуральной 10 жидкости (рН 7,8) подвергают цент— рифугированию для отделения мицелиальной массы и всплывающего слоя.

Полученный осадок суспендируют в

1600 л метанола и смесь перемешивают в течение 2 ч. Нерастворимые вещества отфильтровывают, а метанольный экстракт концентрируют в вакууме до 43 л. Всплывший слой, содержащий активные вещества, экстрагируют дважды 1000-литровыми порциями н-бу-. танола. н-Бутанольные экстракты и концентрированный метанольный экст ракт объединяют и упаривают азеотропно с помощью периодического добавления воды к водному раствору (20 a)> получают маслянистое твердое вещество. Последнее дегидрируют в 30 л метанола, а нерастворимые вещества отфильтровывают. Метанольный экстракт.концентрируют в вакууме до

10 л, затем добавляют 40 л этилацетата и 30 л воды. Смесь перемешивают в течение 30 мин, органический слой отделяют, сушат над сульфатом натрия и упаривают в вакууме до

4 л. Концентрат вливают в 20 л н-гексана, получают бледно-желтое твердое вещество — неочищенный комплекс

ВВМ-1675 (90,14 г, активность

55 мкг/мг).

20 r комплекса растворяют в 20 мл метанола и наносят на колонку из сефадекса KH-20 (размером 5,5х85 см) .

Колонку проявляют метанолом. Активные элюаты (контроль с помощью Staphylococcus aureus 209P) объединяют, концентрируют в вакууме и лиофилизируют. Получают 4,19 г полуочищенного комплекса. Далее проводят хроматографию на колонке из силикагеля (5,0 х 50 см) с использованием хлороформа и метанола (с увеличением количества последнего от 1 до 57 V/V) в качестве элюента. Элюенты объединяют с учетом антибактериальной активности и тонкослойной хроматографии (ТСХ)(кремнезем — CHC1> . СН ОН =

5:1 V/V) и концентрируют в вакууме.

Получают почти гомогенный компонент

А (выход после упаривания 351 мг), элюируют 27.-ным метанолом в хлороформе, а затем элюируют смесь компонентов А, А и Аq (507 мг) с последующим элюированием смеси компонентов В (210 мг) 37.-ным метанолом в хлроформе. Твердое вещество компонента А наносят на колонку из сефадекса LH-20 (2,0 х 80 см), которую проявляют метанолом. Активные фракции концентрируют в вакууме досуха и полученное твердое вещество кристаллизуют из метанола. Получают бесцветные пластины чистого компонента А (124 мг).

Комплекс ВВМ-1675 А, Аз и А разделяют с помощью хроматографии на колонке из Бондарпак С„ (30 х х 50 см) . Элюирование проводят водным ацетонитрилом и биологически активные элюаты проверяют с помощью

ТСХ (силикагель в обратной фазе—

CH)CN : Н О = 75:25 V/V). 33 мг Ар и 18 мг А> элюируют последовательно

20Х-ным ацетонитрилом (301 Mr ), а

3. макс. (нм) Абсорбционная способность

12,4

320

280 плечо

253

25,1

25,5

210

7 134 затем элюируют компонент А 50Х-ным ацетонитрилом.

Твердое вещество, содержащее компоненты В и В, хроматографируют на колонке из силикагеля (3,0х х 40 см)с использованием хлороформа и 4 -ного метанола в качестве проявляющего растворителя. Активные фракции объединяют и упаривают. Получают 7 мг компонента В . Компонент В элюируют 5Х-ным метанолом в хлороформе, после упаривания получают 8 мг компонента В .

Пример 3. Очистка компонента А,.

Колонку Гленко (2,67 х 75 см) наполняют .суспензией октадецил (CJII ) силикагеля Вейкер в связанной фазе (размер частиц 40 мкм) в метаноле.

Колонку подсоединяют в систему HPLC со средой под давлением и уравновешивают 1,5 л элюента (4-1,6Х ацетонитрила, 21,6Х метанола, 36,8 0,1М ацетата аммония). 100,5 мг частично очищенного компонента А,, полученного по примеру 2, растворяют в 2 мл ацетонитрила. Полученный образец пропускают через колонку. Колонку элюируют тем же элюентом и собирают

87 мл фракции. Элюент контролируют при 254 нм и 340 нм. Фракции 55-71 сливают и эктрагируют дважды по

1500 мл хлороформа. Хлороформ упаривают досуха, получают 89,8 мг остатка (С) .

Колонку Гленко (1,5х20 см) заполняют суспензией 12 r силикагеля

Moelm с размером частиц 60-200 мкм.

Остаток (С) наносят на колонку в растворе хлороформа. Колонку элюируют 500 мл линейного градиента хлороформа до 10Х метанола в хлороформе, собирают фракции по 20-25 мл. Фракции 6-9 сливают и упаривают досуха, получают 73 мг остатка (O).

Колонку Гленко (1,5х20 см ) наполняют суспензией 12 г силикагеля

Moelm с размером частиц 63-200 мкм в Скеллизольве В. Остаток (О) растворяют в 2 мл хлороформа и наносят на колонку. Хлороформ заменяют 15 мл

Скеллизольва В. Колонку элюируют

500 мл линейного градиента Скеллизоль ва В до 60Х ацетона в Скеллизольве В, собирают фракции по 26-25 мл. Фракции 19-23 сливают и упаривают досуха.

4249 8

Получают 65, 6 мг чистого компонента А

Компонент А представляет собой кристаллы белого до бледно-желтого

5 цвета ° Температура плавления 156о

158 С (с разложением) .

Элементарный анализ: С - 52,17Х, Н вЂ” 6,15Х; М вЂ” 4,63 ; S - 9,09, 10 Π— 27, 96 ..

Спектр УФ абсорбции (Вариан УФ, Сагу 219, растворитель — метанол, концентрация 0,01356 г/л):

Оптическое вращение (растворитель — CHClJ ):j ) = - 207 (С =

0,0351);PXj = - 191 (С вЂ” 0,5, CHCl ) .

При тонкослойной хроматографии на силикагеле (система растворителей

СНС1з: СНз ОН 5 1 ЧIМ Rp 0 74 на силикагеле в обратной фазе . (СН CN: Н 0 — 75: 25 Ч/V) К О, 18.

Основные полосы поглощения (КВг):

35 985,1015 1070 1110 1150 1210

1250, 1308, 1380, 1405, 1446, 1520, 1592, 1608, 1668, 1715, 2920,2960, 3360, 3440 см . Мол.м. 1248.

Растворим в хлороформе, этилаце тате, ацетоне, этаноле и метаноле; слабо растворим в бензоле и воде; нерастворим в н-гексане и четыреххлористом углероде.

45 Дает положительную реакцию с хлор ным железом, реактивами Эрлиха и Толлена; отрицательную реакцию в опытах

Сакагучи> с нингидрином и антроном.

Обладает антибактериальной активностью в отношении различных бактерий и грибов; индуцирует профаг в лизогенных бактериях; ингибирует рост лейкемии P-388, лейкемии L -1210, меланомы В16 и легочной карциономы

55 юиса (на мышах).

Очистка компонента А .

Колонку Гленко (внутренний диаметр 2,65 см) наполняют суспензией октадецил (С ) силикагеля Baker в

1344249

282.

16,3

26,2

252

Аз

Свойства

Точка плавления о, (разложение), С . б

Г 1ь (С=О,5, СНС1 ) 156-159

159-161

123-126

125-127. -122

-171

-176

-161

Элементарный анализ

С вЂ” 54,55%

Н - 6,46

N — 3,73

S — - 7,49

С вЂ” 54,65%

Н вЂ” 6,29%

N — 3,51Х

S — 8,07Х

Π— 27,77% 0 — 27,48%

В МеОН

253(286) 253(257) 253(225) 248(212) связанной фазе в метаноле (размер частиц 40 мкм ) Колонку присоединяют к системе HPLC со средним давлением и уравновешивают 1,5 л элюента (50% ацетонитрила, 20Х метанола, 30%

О,IM ацетата аммония). 76,9 мг частично очищенного компонента А (полученного по примеру 2) растворяют в

2 мл ацетонитрила и готовят образец.

Последний наносят на колонку, кото" рую элюируют тем же элюентом. Собирают 87 мл фракций 31-.38, экстрагируют дважды по 500 мл хлороформа.

Хлороформ упаривают досуха., Получают

65,8 мг гомогенного компонента А .

Компонент А„ имеет вид белых кристаллов; растворим в хлороформе, этилацетате, ацетоне, этаноле, метаноле; слабо растворим в бензоле и воде; не растворим в н-гексане и четыреххлористом углероде. Дает положительную реакцию с хлорным железом (3), реактивами Эрлиха и Толлена; отрицательную реакцию в опытах Сака- 25 гучи, с использованием нингидрина и антрона. о

Точка плавления 147-149 С. Угол

27о ф оптического вращения() = 179,4 (С = 0,5,СНС1з ), мол.м..1248.

Элементарный состав: С 52,71Х;

H 5,94%; N 3,94%; S 9,39%;

0 28,01% °

0,71 (ТСХ на силикагеле, система растворителей — хлороформ:метанол

5:1 Ч/V); R> 0,21 (силикагель в об ратной фазе, ацетонитрил:вода—

75:25 Ч/Ч) .

УФ абсорбция (метанол,О,02052 г/л): (нм) Абсорбционная

Я макс. способность

320 12,2

214 25,8

ИФ-спектр (KBr): 950, 1015, 1070, 1100, 1155, 1213, 1250, 1313, 1375, -1405,1450, 1520, 1595, 1610, 1685, 1735, 2940, 2980, 3440 см " .

Обладает антимикробной активностью в отношении различных бактерий и .грибов; индуцирует профаг в лизогенных бактериях; ингибирует рост лейке-. мии P-388, лейкемии L-1210, меляномы Б16, легочной карциномы Льюиса (на мьппах).

В таблице приведены физико-механические свойства компонентов А, А„В,, В,.

1344249

Продолжение таблицы

282(158) 282(153) 282 (140) 279(141)

320(122) 320(117) 320(104) 318(103) в 0,01 н.

НС1-МеОН

253(287) 253(258)

282(160) 282(155)

320(126) 320(118) 253(.225) 248(210)

282(140) 279(140)

320(105) 318(103) в 0,01 н.

Na0H-МеОН

252(280) 252(266)

283(162) 283(160)

318(120) 318(118) .252(236) 248(233)

283(141) 278(230)

318(105) 318(110) Растворимость: хлороформ

Растворим Растворим Растворим Растворим этилацетат ацетон этанол метанол бензол

Слабо

Слабо

Слабо

Слабо

Растворим Растворим вода

Растворим Растворим

Не растворим

Не растворим

Не растворим н-гексан

Не растворим четыреххлористый углерод

Все компоненты дают положительную реакцию с хлорным железом (3), с реактивами Эрлиха и Толлека и отрицательную реакцию — в опытах Сакагучи, с нингидрином и антроном.

Обладают антимикробным действием в отношении различных бактерий и грибов (стафилококков, микробактерий, эшерихий, клебсиелл, псевдомонад, различных видов Сапд1da H pp.) 50

Индуцируют профаг в лизогенных бактериях, компоненты А1 и А4 ингибируют рост лейкемии P-388.

Следующим пример иллюстрирует способ получения антибиотического комплекса с помощью культуры Actino-, madura verrucosospora АТСС 39638.

Пример 4. Вегетативную среду, содержащую 2% растворимого крахмала, 1Х глюкозы, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% ЙВ-амина типа А и

0,1% карбоната кальция, рН до стерилизации 7,0, засевают культурой штамма А7СС 39638. Посев инкубируют при о

32 С в течение 4-х дней на вращающемся встряхивателе (250 об/мин).

Затем 5 мл полученной культуры переносят в колбу Эрленмейера объемом

500 мл со 100 мл ферментационной среды (3% тростниковой мелассы, 1% кукурузного крахмала, 1Х рыбной муки, 0,005Х пентагидрата сульфата меди, 0,05% гептагидрата сульфата магния, 0,1Х карбоната кальция, рН стерилизации 7,0) .

Ферментацию осуществляют при

28 С в течение 7 дней на вращающемl3 134424 ся встряхивателе. Получают 1,5 мкг/

/мл антибиотического комплекса.

Пример 5. Полученный па примеру 4 ферментационпый бульон (3000 л рН 7,6) разделяют на мицелиальную лепешку и всплывший слой.

Мицелиальную лепешку экстрагируют 2000 л метанола в течение 1 ч и фильтруют. 10

Активные вещества, содержащиеся во всплывшем слое, экстрагируют

1800 л н-бутанола.

Метанольный и н-бутанольный экстракты объединяют и концентрируют 15 азеотропно при периодическом добавлении воды (20 л ) к водному раствору, при этом осаждается маслянистое твердое вещество. Смесь встряхивают 3 раза с 20 л (на каждое встря- 20 хивание) этилацетата. Экстракты объединяют, фильтруют и упаривают до

4 л ° Концентрат смешивают с 30 л н-гексана при перемешивании и получают твердое вещество бледно-желтого цвета. (81,7г, активность 59 мкг/

/мг). Неочищенный комплекс (20 r) растворяют в 20 мл метанола и наноцят на колонку Сефадекса Н-20 (5,5х х85 см). Колонку проявляют метано- 30 лом, элюирование контролируют методом биологического анализа с использованием Б арЬу1ососсыз аигеоз 209Р.

Активные элюенты объединяют кон35 центрируют в вакууме и лиофилизируют.

Получают 4,86 r комплекса, активность

203 мкг/мл. Полученное вещество хроматографируют на колонке из силикагеля (3,0х70 см) с использованием хло- 40 роформа и увеличивающегося от 1 до

5Х количества метанола в качестве проявителя. Элюаты проверяют на антибактериальную активность и методом

ТСХ, затем обыединяют и концентриру- 4 ют в вакууме.

Концентрат элюируют 2Х-ным мета" иолом в хлороформе, получая 425 мг (после выпаривания) компонента А с активностью 960 мкг/мл, а затем

732 мг смеси компонентов А, Аз и А (активность 340 мкг/мг), с последующим элюированием ЗЖ-ным метанолом в хлороформе комплекса компонентов

В и В (200 мг, активность 190 мкг/

/мг) °

Полученный выше компонент А„ повторно хроматографируют на колонке с силикагелем (2,2х44 см) с использо9

14 ванием 2Х-ного метанола в бензоле.

Фракции, содержащие гомогенный компонент А,, упаривают в вакууме досуха. Полученное плотное вещество кристаллизуют из 10 мл метанола. Получают бесцветные кристаллы компонента А, (197 мг, активность

1000 мкг/мл).

Комплекс А,,А и А < (537 мг) разделяют с помощью хроматографии на колонке из Бендапак С„ (2,0 х х 42 см) . Элюируют водным ацетонитрилом и биологически активные элюаты проверяют с помощью ТСХ (Мерх, силикагель в обратной фазе — СН ON: з

:Н О = 75: 25 V/V) .

Компоненты А (45 мг, активность

410 мкг/мг) и А> (19 мг, активность

300 мкг/мг) элюируют 20Е-ным ацетонитрилом, а затем 50Х-ным ацетонитрилом, элюируют компонент А (?03 мг). Фракции компонента А кристаллизуют иэ смеси хлороформ-н-гексан. В осадок выпадают бесцветные палочки (70 мг, активность 290 мкг/мг) .

Плотное вещество, содержащее компоненты В и В, хроматографируют на колонке из силикагеля (3,0х40 см) с использованием хлороформа и метанола в качестве элюирующего раствора.

Активные фракции> элюированные 47ным метанолом в хлороформе, объединяют и упаривают. Получают 7 мг чистого компонента В с активностью

180 мкг/мг. Компонент В элюируют

57.-ным метанолом в хлороформе и после упаривания получают 8 мг компонента В с активностью 140 мкг/мг.

Использование предлагаемых способа и штаммов-продуцентов позволяет получать группу новых антибиотиков, обладающих широким антимикробным спектром, индуцирующих профаг в лизогенных бактериях и обладающих противоопухолевым действием в отношении лейкемии, меланомы, легочной карциномы. Льюиса.

Формула изобретения

1 ° Способ получения компонентов

А,А,A>,À,„ или В антибиотического комплекса BBM-1675, обладающих антимикробным и противоопухолевым действием, заключающийся в том, что штамм Actinomadura verrucosospora АТСС 39334 или штамм Actinomadura

44249

Составитель. Г.Смирнова

Редактор Г.Волкова Техред А.Кравчук Корректор А. Зимокосо в

Заказ 4840/59 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул. Проектная, 4

15 13

verrucosospora АТСС 39638 культивируют в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, asoта и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях, в течение от

68 ч до 7 дней при скорости аэрации от 0,667 до 1,2 л воздуха/мин/л ферментационной среды, далее отделяют мицелий от ферментационной жидкос ти, экстрагируют,порознь органическими растворителями, экстракты объединяют, концентрируют, полученный полуочнщенный комплекс разделяют методом хроматографии, элюируют компоненты комплекса органическими растворителями и очищают целевые продукты.!

2. Штамм актиномицета Actinomadura verrucosospora АТСС 39334 и штамм актиномицета Actinomadura verrucosospora АТСС 39638 (American Type Cu I.1p ture col1ection),èñïoëüsóåìûé для получения компонентов А,А,А,А4, В, или В антибиологического комп-, лекса ВВМ-1675, обладающих антнмикробньм и противоопухолевым действи16 ем.