Циклический аналог энкефалина, обладающий анальгетической активностью

 

Циклический аналог энкефалина формулы Н-Туг-Р -prn-Gly-Phe обладающий анальгетической активностью ..

СОЮЗ СОВЕТСИИХ.

КСПИЬ ЛИК (199 (1I) А1 (5р 4 С 07 К 7/64 7/12 А 61 К 37/02

Б: Е6ИЯЫ3

ИП П: — йй, :я%о@Я 1

Б- "БЛИО : E;iA

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ASTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Н-Tyr-D Orn-Gly-Phe3

Известны природные аналоги энкефалина: метионин-энкефалин (Н-Туг-01уGly-Phe Met ОН) и лейцин-энкефалин (H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-0Í), проявляющие морфиноподобную активность в опытах на специфических моделях

ГОСУЛАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

7О ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П<НТ СССР

1 (21) 3561935/23-04 (22) 26;11.82

„(46) 30.08.89. Бюл. У 32 (71) Институт органического синтеза

АН ЛатвССР

М (72) Г.И. Чипенс, И.В. Боброва, Н.А. Абиссова и Г.Ф. Розенталь (53) 547.964.407(088.81 (56) Hughes J. Smith Т.W. Koster,litz Н.W.,Forthergill L.À., Могяап В,А., Morris H.R. "Identification of two related pentafeptides from the Groin

with potent Opiate agonist activity"

Nature, 1975, ч.253, 547.

Buescher Н.Н., Hill R.Ñ., Romer D ° Cardinaux F., Closse А., Nauser D., Pless I. "Evideme for .analgesic activity of enkepha1in

in .phe mouse", Nature 1976, у. 261, 423.

Hudson D. Sharfe R., Szelke М., "Methionins епКерпайп and isosteric

analogues" Int.J. Peptide РгоСехп

Res. 1980, ч.15, 122.

Kessler Н., Holzemann G °, "CycloLeu -ЕпКерЬа11п" Angew Chem. Int ° Ed.

Engl., 1 981, 20, У 1, 124.

Di Maio J., Schiller p.W, "А cyclic епЕерЬа1Ы analog with high in vitro opiate activity. Proc. Natl.Sei.

USA, 1980, 77, 9 12, 7162-7166.

Изобретение относится к новому биологически активному соединениюциклическому аналогу энкефалина, обладающему анальгетической активностью, которое "может найти применение в медицине.

2 (54 ) ЦИКЛИЧЕ СКИЙ АНАЛОГ ЭНКЕФАЛИНА, i

ОБЛАДАЮЩИЙ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Циклический аналог энкефалина формулы обладающий анальгетической активностью.

10955SS

Цель изобретения — расширение арсенала средств воздействия на живой организм.

° Поставленная цель достигается опиа- сываемым циклическим аналогом энкефалина формулы

Н-Tyr-D-Or n-Gly-Phe =.

0Н

ВОС

9 g

Сиена синтеза цинао-PI -Э Оси, дез-gaea /- зикефаиин опиатного рецептора и подавляющие стереоспецифическое связывание с рецептором опнатного антагониста налоксона в гомогенатах мозга, Однако и метионин и лейцин-энкеф лины проявляют слабую и кратковременную (5-15 мин) анальгезию при внутрижелудочковом введении в мозг мыши и неактивны при других спо- собах введения.

Известны циклические .аналоги энкефалина (например, -Tyr-61у-С1у-PheLeu), не проявляющие специфической активности энкефалинов.

Наиболее близким по химической структуре является циклический анаф Д Ф Ь

L eu, однако анальгетическая активность этого циклоаналога не исслеу ована. обладающим анальгетической активностью.

Описываемое соединение синтезировано по приведенной схеме ступенчатым наращиванием пептидной цепи с использованием активированных эфиром трет-бутилоксикарбониламинокислот. Для- защиты 8 -аминофункцин

D-оонитина используют бензилоксикарбонильную группу, гидроксила тиро20 зина — трет-бутилокснкарбонилвную ,группу.

1095588

Пример. Для синтеза описываемого аналога энкефалина используют аминокислоты и их производные фирмы "Reanal" (Венгрия). Все аминокислоты, кроме D-орнитина, имеют

L-конфигурацию. Температуру плавле ния веществ. определяют в капилляре . (без коррекции). Индивидуальность промежуточных соединений контролируют с помощью ТСХ на пластинках

Silufol (ЧССР), аналог энкефалина хроматографируют на стеклянных пластинках с закрепленным слоем силикагеля Silika Gel 60 F-254 фирмы

"Merck" (ФРГ).

Используют следующие системы раст:ворителей: хлороформ-этанол — уксусная кислота (АсОН), 85:10 5 (А), н-бутанол-пиридин — АсОН вЂ” Н О 15: .:10:3:6 (В)< н-бутанол-АсОН-НдО, 4:1:1 (С), хлороформ — метанол—

АсОН вЂ” Н О, 30:20:4,6 (Д); 60:18:2:3 (Е), н-бутанол — пиридин-АсОН-Н О

15:12:3:10 (Е). Удельное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре РегИ.n Elmer 14/M (США). Кис лотный гидролиз проводят при 120 С в течение 24 ч. Аминокислотный состав определяют .на анализаторе Jeol-3.

Для всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием.

Спектры SIMP — Н описываемого.аналога энкефалина получены на спектрометре MM-360 в растворе D О при рН 5, : температуре 23 С с внутренним стандартом DSS.

Молекулярный вес описываемого циклопептида определяют масс-спектромет,рически на приборе СН-5 Чаг an МАТ ,(США).при температуре приблизительно о

:250 С и ионизирующем напряжении 70 ЭВ.

N-.òðåò-бутилоксикарбонил-глицил-фенилаланин (5) °

6,6 г (40 ммоль) L-фенилаланина растворяют в 40 мл 1 н.раствора гидроокиси натрия, добавляют 3,34 r бикарбоната натрия, 50 мл диметилформамида (ДМФА) и 16,94 г (40ммоль) пентахлорфенилового эфира трет-бутилоксикарбонил-глицина, растворен,ного в 20 мл ДМФА. Смесь перемешивают в течение нескольких часов. После завершения реакции(хроматографический контроль) реакционную массу разбавляют этилацетатом и водой (до разделения слоев), охлаждают до О С и подкисляют 0,5 н. соляной кислотой до рН 3. Этилацетатный слой отделяют, водную фазу экстрагируют повторно. Объединенный этилацетатный слой промывают водой, насыщенным раствором хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. Кристаллический осадок, полученный после отгонки растворителя, 10 перекристаллизовывают из этилацетата с небольшой добавкой петролейного эфира. Выход дипептида (5) - 11,4 (86 ), т.пл. 144" 135О С, POCQ +15 7 (с.1, ДМФА), Rf 0,73 (А), Rf 0,80 (Д)

15 N -трет-бутилоксикарбонил, И -бензилоксикарбонил-D-орнитилглицил-фенилаланин (7);

1 0,9 г (33,8 ммоль) дипептида (5)iрастворяют в 50 мл 707-ного расуво20 ра трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане и выдерживают 30 мин.

Растворитель отгоняют, остаток растирают эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром на фильтре и сушат в

25 вакууме над гидроокисью калия.

Получают 10,4 r (91 ) трифторацетата дипептида 1,61 0,63 (Д) °

5,2 (15,5 ммоль) трифторацетата (6) растворяют в 50 мл ДМФА, ох30 лаждают. до О С и при охлаждении добавляют 2, 65 мл (15,5 ммоль)диизопропилэтиламина в 15 мл ДМФА и 8,2 r (15,5 ммоль) пентафторфенилового эфира N -трет-бутилоксикарбонил, Ы»

35 N бензилок арбонил-р-орнит а. растворенного в 15 мл ДМФА. Реакци-онную массу перемешивают несколько часов и после завершения реакции обрабатывают аналогично соедине—

40 нию (5).

Продукт, полученный после отгонки растворителя, очищают на колонке с силикагелем фирмы "Merck".Ýëþирование проводят в системе: хлороформ - этанол — этилацетат — АсОН—

Н„ О 285:5:8:2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме.

Получают 5,9 r (67Ж) масла защи50 щенного трипептида (7)с Rf 0,65 (А);

Rf 0 72 (В). "

О-ди-трет-бутилоксикарбонил-тирозил N -бензилоксикарбонил-D-орни9 тил-глицил-фенилаланин (9).

20,0 r (35 ммоль). трипептида (7) растворяют в 100 мл 507.-ного раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане и выдерживают в течение

20 мин. Растворитель отгоняют, ос1095588 таток растирают с эфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают, вновь промывают эфиром и высушивают в вакууме над гидроокисью калия. Получают 19,2 (94%) трифторацетата трипептида (8) с Rf 0,62 (Д) °

18,1 r (31 ммоль) трифторацетата трипептидaJ (8) растворяют в

100 мл ДИФА, охлаждают до О С, добавляют при перемешивании 5,3 мл (31 ммоль) диизопропилэтиламина в

10 мл ДИФА и 16,6 г (31 ммоль) пентафторфенилового эфира N,О-ди-третбутилоксикарбонил-L-тирозина. Реак- 15 ционную массу перемешивают ),5-2 ч (хроматографический контроль) и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению (5). Продукт, полученный после отгонки этил-:20 ацетата, размешивают с эфиром и охлаждают. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат в эксикаторе. Выход: 16.,0 r (63X) с

Rf 0,75 (А), Rf 0,55 (В), )<3 25

+5,6 (с. 1, ДИФА).

N О-ди-трет-бутилоксикарбонил-тироЭ зил-цикло(Б — Д-орнитилглицил-фенилалайил-) (II) °

К 1,8 r (2,2 ммоль) защищенного 30 тетрапептида (9) в .50 мл метанола, 5 мл АсОН и 2 мл Н О добавляют паллодиевую чернь и гидрируют в течение нескольких часов. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают.

Остаток растирают с эфиром, затем дважды переосаждают из спирта эфиром, вновь промывают эфиром и сушат в вакууме над гидроокисью калия. Получают

1,2 r (81%) тетрапептида (10):.с Rf 0

0,83 (Д), Rf 0,77 (Т).

500 мг (0,7 ммоль) тетрапептида (10) растворяют в 500 мл очищенного .ДИФА, охлаждают до -20 С, прибавляют триэтиламин до рН 7,2 и медленно прикалывают 0,45 мл (2,1 ммоль) дифенилфосфорилазида в 50 мл ДИФА.

Раствор перемешивают в течение 7 дней и поддерживают рН 7 периодическим добавлением триэтиламина к реакционной массе. По завершении рео акции растворитель отгоняют при 40 С к остатку добавляют 1-1,5 мл этилацетата и небольшое количество эфи5 ра. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром, сушат в вакууме. Получают 355 мг белого порошка защищенного циклического тетрапептида (II) Ввиду плохой растворимости, (II) очистку не проводят.

Тирозил-цикло(Н -D-орнитил-гли6 цил-фенилаланил-) (I) .

350 мг (0,5 ммоль) защищенного циклического тетрапептида (II) растворяют в 5 мл 70%-ного TFA в хлористом метилене и выдерживают 30 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме. Полученный продукт очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе "Du Pont-830". Элюирование осуществляют смесью: этанол—

0,1 М раствор ацетата аммония, 20:80.

Соответствующие фракции собирают и лиофилируют.

Выход 70 мл (28X) циклотетрапептида энкефалина (I),I j +55 (с 1

0,2 н, АсОН); Rf 0,82 (D), Rf 0,83 (F), аминокислотный состав: Gly 1,05, Phe 0,98; Tyr 0,92; Orn 1,07 E His

О, 72 (1, О м раствор/АсОН, 950 в) °

При изменении..рН от 5 до 2 наблюдается отсутствие изменения химического сдвига Н Phe что указывает на отсутствие свободной карбоксильной группы у тетрапептида, а следовательно, подтверждает циклическое строение.

Во-вторых, большая неэквивалентность 11 -протонов Îrn (а0 . 0,45 м.д. также подтверждает циклическое строение полученного соединения.

Величина расчетного молекулярного . веса совпадает с его эксперименталь.— ным значением,,определенным массспектрометрически (М =, 481).

Исследована биологическая активность описываемого циклического аналога энкефалина в опытах in vivo.

Анальгетическую активность определяют по методу Н.Usda.. В работе использованы беспородные мыши-самцы массой, 18-22 г. Исследуемое вещество, растворенное в стерильном физиологическом растворе, вводят при помощи

У-образной иглы в usterna magna мозга неанестезированньпч мышам в количестве 10 мкл. Исследовался диапазон доз от 0,075 до 1,0 мкг/жив. Каждая экспериментальная группа состояла из

8-10 мышей. Анальгетический эффект оценивают по методу itazl pinch" при помощи зажима, накладываемого на основание хвоста. Определение болевой

1095588

Таблица l

Химические сдвиги Н циклического тетрапептида

7,15; 6,90

4,19 3,19 3,02 4,19 1,71, 1,41

Tyr

1,41, 1,21

3,24; 2,79

4,1,1 3,40

4,58 3,11, 2,96

Cly

Phe

7,27-7,30 реакции проводят через 5,15,30,60, 90 мин после введения. Результаты выражены альтернативным методом в проценте мышей, показавших анальгети5 ческую реакцию. При вычислении ЕД зо (зффективная доза исследуемого вещества, которая вызывает анальгетиче. скйй эффект у 50Х подопытных живот-ных) используют метод Литчфилда и .Уилкоксона.

Анальгетическая активность. иссле-, дуемых соединений приведена в табл.2 и 3.

Как в дно из табл.2 описываемый цикло-(N -D Orn+, дез-Leu+) энкефалин обладает выраженной анальгетической активностью. Максимальный эффект наблюдается на 5 минуте после введения. Анальгетическая активйость описываемого циклического аналога энкефалина (1) значительно превышает активность природных метионин и лейцин-знкефалинов и в

7,5 раз превышает анальгезию морфина на молярной основе (см.табл.2).

Более того, описываемый циклический аналог энкефалина в .отличие от природных энкефалинав активен при внутривенном введении. Его активность (ЕД = 32 (20-52) ммоль/кг) составляет более половины (567) активности морфина (ЕД = 18 (15-21) ммоль/кг)(см.табл.3). Продолжительность анальгетической реакции описываемого соединения составляет 60 мин против 15 мин у природных энкефалинов (2,3) при интрацистернальном введении (см.табл.2) и равна продолжительности действия морфина при обо.их способах введения (см.табл.2,3) ° Ведение описываемого соединения в дозе 200 мг/кг не вызывает токсических эффектов. Учитывая, что эффективная доза описываемого аналога энкефалина — 32 мкмол/кг, что составляет 20 мг/кг, рассчитан терапевти200 Mr/zr декс- 200 = 10, :ò.е.

200 мгукг описываемое соединение обладает достаточно безопасным интервалом для терапевтического действия. Результаты проведенных биологических испытаний позволяют сделать вывод о возможности использования предлагаемого соединения в медицине.

1095588

Таблица 2

Анальгетическая активность энкефалина и его циклического аналога при интрацистернальном введении мышам (метод tail pinch), ПродолжительВремя максиОтносительная анальгеСоединение ность анальгезии 2, мин тическая активность 1 морфин

1 -Эффективная доза рассчитана на момент максимального эффекта.

2",-при ЕД о во р

3 -в работе использовался морфин-гидрохлорид производства Ташкентского ХФЗ.

Таблица 3 и

Анальгетическая активность цикло-(N -D-Orn дез Lel1 )-энкефалина при внутривенном введении мышам (метод "tail pinch") ..

Относитель- . ная анальгетическая активность (морфин

100K) ЕДза> ммоль/кг

Соединение

Цикло-(N-.D-Orn, дезLeu+)-энкефалин

60

32(20-52) 100

18 (15-21) Морфин

Texpep M.Морген%ал Корректор М. Пожо

Редактор О. филиппова

Заказ 4975 Тираж 339 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

1.,Цикло- (М -D-Orn

1 дез- Leu )-энкефалин

2.,Лейцин-энкефалин.

З. Метионин-энкефалин

4.Морфин

ЕД o ммоль/животное

0,16(0,08-0,33)

174 (102-281 )

) 54 (90-261 )

1,2(0,6-2,2) мального эффекта, мин

5

5-15

Продолжительность анальгезии при ЕД мин

16

7,5

0,007

0,008