Аналоги энкефалина, обладающие анальгетической активностью

 

Аналоги энкефалина ойцей форму Tyr-DOrn-Gly-Phe-y X-J У ОН ОН ОН Pro Leu , где Asn Pro NH, обладающие анальгетической активностью . (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ социАлистичесних

РЕСПУБЛИК

С07 К7/)2, А61 K37/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ.- саЛ):О и Гг .Р, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ по изов етениям и отнРытиям

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3561936/23-04 (22) 24.11.82 (46) 07.10.90. Бюл. М 37 (71) Институт органического синтеза

АН ЛатвССР (72) И,В. Боброва, Г.И.Чипенс, Н.А.Абиссова и В.Д.Григорьева (53) 547 ° 964. 4. 07(088. 8) (56) Hughes J. и др. Identification

of tvo related pentapeptides,from

the bravi witt àðîéåï opiate agonist

activity Nature, 1975, 253, рр.577579.

8uescher Н. и др. Evidence for

analgeyi1 activity of enkephalin in

the Nature. )976, 261, рр.423-425.

КйЬойа И. и др. Еп)серЬа1Ы anologs containing the olipeptidi unit

Tyr-Arg (Kyot orphin), Chem. Pharm.

Ви11., 1980, 28, 8, рр.2580-2586.

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям— аналогам энкефалина, обладающим анальгетической активностью, которые могут найти применение в медицине.

Энкефалин — природный антагонист опиатного рецептора в мозгу, был выделен и: йдентифицирован в виде смеси двух пентапептидов . Н-Tyr-Gly-Gly-Phe Met-ОН (метионинэнкефапин) и

Н-Туг-С1у-Gly Phe-LeuOH (лейцилэнкефапин). Оба пептида проявляют морфиноподобную активность в опытах на специфических моделях опиатного рецептора, а также подавляют стерео-.

„,SU„„1116698 а 3

2 (54) АНАЛОГИ ЭНКЕФАЛИНА, ОБЛАДАЮПЯЕ

АНАЛЬГЕТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТЬЮ (57) Аналоги энкефалина общей форму-:

Т9).-1)ОГ))-G),y-Р)1 х-3

V у

I Pro ОН где I Leu ОН

Е

Asn ОН

I Pro NH обладаюшие анальгетической активностью.

Фе специфическое связывание с.рецептором. опиатного антагониста налоксона в го - " ра) могенатах мозга. .Met- u Leu- энкефалины показывают анальгеэию в течение 5-15 мин при внутрижелудочковом введении B мозг мыши °

Наиболее близким к описываемому соедИнению является аналог энкефалина (D-Arg ) — энкефалин, содержащий во втором положении D-изомер аминокислоты с основными свойствами, проявляющий анальгетическую активность при внутримозговом введении и не обла дающий анальгеэией при внутривенном введении.

1116698

Цель изобретения — поиск новых пептидных производных аналогов энкефа.лина, обладающих более высокой ана.-ь-, гетической активностью, чем известные,5 природные энкефалины или их синтетические аналоги.

Поставленная цель достигается описываемыми аналогами энкефалина общей формулы 3

15 где I Pro ОН

Т Leu ОН

I Asn ОН

I Pro NH<

Описываемые соединения синтезиру- 20 ют известными методами пептидной химии в растворе согласно приведенной схемы с использованием активированных эфиров трет-бутилоксикарбонил- аминокислот. 25

Для синтеза аналогов энкефалина (Х вЂ” Z ) используют аминокислоты и их производные фирмы "Regnal" (Венгрия). Все аминокислоты, кроме D-орнитина, имеют L-конфигурацию. Темпе- 30 ратуру плавления веществ определяли в капиллярах (без коррекции). Индивидуальность промежуточных соединений контролировали с помощью ТСХ на пласт тинках 8 1ийо1 П 4 (ЧССР).Для хрома- 35 тографии аналогов энкефалина применяли стеклянные пластинки с закрепленным слоем силикагеля Silika Gel 60

Р-254 » фирмы "Merck" (ФРГ). Использовали следующие системы растворителей: 40 хлороформ — этанол — уксусная кислота (АсОН) 85:10:5 (А); н-бутанол-пиридин-АсОН5-Н О 15:10:3:6 (Б); н-бутанол -/АсОН вЂ” Н О 4:1:1 (В); хлороформ-метанол-АсОЙ-НоО 30:20:4:6 45 (B) 60:18:2:3 (Г); н-бутанол-пири. дин-АсОН-Н О 15:12:3:10 (D). Удель ное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре "Perkin Elmer

141М" (США). Кислотный гидролиз проводят при 120 С в течение 24 ч. Аминокислотный состав определяют па анализаторе Ieol-3.

Для всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием С, Н и др.

Пример 1. N-трет-бутилоксикарбонилглицилфенилалании (4). б,б г (40 ммоль) L-фенилаланина (2) растворяют в 40 мл 1 н.раствора гидроокиси натрия, добавляют 3,34 г бикарбоната натрия, 50 мл диметилформамида (ДМФА) и 16,94 г (40 ммоль) пентахлорфенилового эфира трет-бутилоксикарбонилглицина (3), растворенного в 20 мл ДМФА. Смесь перемешивают в течение нескольких часов. После завершения реакции (хроматографический контроль) реакционную массу разбавляют этилацетатом и водой (до разделения слоев), охлаждают до 0 С о и подкисляют 0,5 н. соляной кислотой до рН 3. Этилацетатный слой отделяют, водную фазу экстрагируют повторно, Объединенный этилацетатный слой промывают водой, насыщенной раствором хлористого натрия, и сушат над безводным сульфатом натрия.

Кристаллический осадок, полученный после отгонки растворителя, перекристаллизовывают из этилацетата с небольшой добавкой петролейного эфира.

Выход дипептида (4) — 11,4 r (88%); т.пл. 133-135 С; (6J + 15,7 (с.

1 ДМФА); Rf 0,73 (А); 0,80 (B}.

N-трет-бутилоксикарбонил-,.N -бензилоксикарбонил-D îðíèòèëãëèöèëôåíèë" алании (7).

10,9 г (33,8 ммоль) дипептида (4) растворяют в 50 мл 70%-ного раствора трифторуксусной кислоты (ТГА) в дихлорметане и выдерживают 30 мин.

Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром на фйльтре и сушат в вакууме над гидроокисью калия. Получают 10,4 r (91%) трифторацетата дипептида (5), Rf 0,63 (В).

5,2 г (15,5 ммоль) трифторацетата (5) растворяют в 50 мп .ДИФА, охлаждают до 0 С и при охлаждении добавляют 2,65 мл (15,5 ммоль) диизопропилэтиламина в 5 мл ДМФА и 8,2 r (15,5 моль) пентафторфенилового эфира N -трет-бутилоксикарбонил, N— бензилоксикарбонил-D-орнитина (6), растворенного в 15 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивают несколько часов и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению,4. Продукт, полученный после отгонки растворителя, очищают на колонке с силикагелем фирмы "Merck", Элюирование проводят в системе хлороформ-этанолэтилацетат-АсОН-Н О 285:5:8:2:0,25.

111669

Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме.

Получают 5,9 r (67%) масла защищенного трипептида (7) с Rf 0,65 (А), 0,72 (Б).

N,0-ди-трет"бутилоксикарбонилти" разил-N -бензилокси-карбонил-D-орнитилглицилфенилаланин (10).

20,0 г (35 ммоль) трипептида (7) растворяют в !ОО мл 50 раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане и выдерживают в течение 20 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром„ Образовавшийся осадок отфильтровывают, вновь промывают эфиром и высушивают в вакууме над гидроокисью калия.

Получают 19,2 г (94 ) трифтораце- тата трипептида 8 ) с Rf 0,62 (Д). 20

18,1 г (31 ммоль) трифторацетата . трипептида (8 ) растворяют в 100 мл

Ь

ДМФА, охлаждают до 0 С добавляют лри перемешивании 5,3 мл (31 ммоль) диизопропилэтиламина в 10 мл ДМФА 25 и 16,6 г (31 ммоль) пентафторфенилового эфира N 0-ди-Вос-Ь-тирозина (9). Реакционную массу.перемешивают 1,5-2 часа (хроматографический контроль) и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению 4.

Продукт, полученный после отгона этилацетата, размешивают с эфиром и охлаждают. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат в эксикаторе. Выход 16,0 r (62 ) защищенного тетрапелтида (10);

Rf 0,75 (А), 0,55 (Б Merck); (Ы +

+ 5,6 (с.11ДИФА).

- N-О-ди-трет-бутилоксикарбонил4-. ;40 тирозил-1Б -(Н -бензилоксикарбонилпролин)) D-орнитилглицилфенилаланин (!2).

К l8 г (2,2 моль) защищенного тетрапептида (10) в 150 мл метанола, 15 мл АсОН и 20 мл воды добавляют палладиевую чернь и гидрируют в течение нескольких часов. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают.

Остаток растирают с эфиром и фильтруют, затем дважды переосаждают из спирта эфиром, вновь промывают эфиром и сушат в вакууме над гидроокисью калия, Получают 13,8 r (91 ) тетрапелтида (l l) с Rf 0, l 5 (A); Rf О, 72 (В, "Мегс1с").

5,1 г (6,8 ммоль) тетралептида (Il) растворяют в 100 мл ДИФА и при перемешивании и охлаждении до8 6 бавляют 1,16 мл (6,8 ммоль) диизопропилэтиламина в 3 мл ДИФА и 2,8 r (6,8 ммоль) пентафторфенилового эфира N-бензилоксикарбонил"L-лролина растворенного в 15 мл ДМФЛ. Через

2-3 ч реакци. нную массу обрабатывают аналогично соединению 9. Продукт, полученный после отгонки растворителя, очищают на колонке с силикагелем фирмы "Merck". Элюирование проводят в системе хлороформ-этанол-этилацетат-АсОН-Н О 185:5:8=2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме. Получают 4,3,r (68 ) защищенного пентапептида (12). с (MAL — 17 (с, 1, ДИФА); Rf 0,79 (В. "Merck"); 0,65 (Г. "Merck™) .

N,О-ди-трет-бутилоксикарбонилтиро-,, зил-jN -(N -бензилоксикарбонил-лейцил}! D-орнитилглицилфенилаланин (13).

Из 5,1 г (6,8 ммоль) тетрапептида (11) и 3,5 r (6,8 ммоль) пентахлорфенилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-лейцина получают пенталептид (13) аналогично соединению 12.

Выход 4,8 г (74X) белого порошка защищенного пентапелтида(13);Я -5

2Ф е (с. 1, ДИФА) Rf Оэ 80 (А) Оэ84 (В) °

N-О-ди-трет-бутилоксикарбонилтиМ розил-IN "(N -бензилоксикарбониласпарагииил))-D-орнитилглицилфенилаланин (14).

Из 5,1 r (6,8 ммоль) тетрапептида (ll) и 3,3 г (6,8 ммоль) нитрофенилового эфира Н-бензилоксикарбонил-О аспарагина получают пенталептид (14) аналогично соединению 12.

Выход 4,7 г (70X) белого порошка защищенного пентапептида (14);(о Д +

+ 8,2 (c.1, ДИФА);Б.К О 72 (А);

О 83 (Б). 3

Тирозил-(N -пропил)-П-орнитилглицилфенилаланин (1л).

К 300 мг (0,32 ммоль) защищенного пентапелтида 12 в 20 мл метанола, 2 мл АсОН и 0,5 мл воды добавляют палладиевую чернь и гидрируют в течение

2-3 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме над гид-. роокисью калия. Полученный продукт растворяют в 5 ил 70 -ного раствора

TFA в хлористом метилене и выдерживают в течение 30 мин. Растворитель отгоняют и остаток растирают с эфиром.

Образовавшийся осадок отфильтровывают, повторно промывают эфиром и сушат в. вакууме. Полученный продукт очи1 16698 щают высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе Du

Pont-830. Элюирование осуществляют смесью этанол- О,lн.раствора ацетата аммония 20: 80. Соответствующие фракции собирают и лиофнлизуют. Вы- . ход 70 r (37 ) разветвленного пентапептида аналога энкефалина (I ); сЦ + 41 (с, 1; 0,2 и АсОН); Rf 0,30 (Б) 0,74 (В), аминокислотый состав. Gly 1,00; Tyr 0,93; Phe 1,10;

0ru 0,93; Pro 1,03.

Пример 2. Тирозил-(N -лейцил)-П-орнитилглицилфенилаланин (Е ).

700 мг (0,73 ммоль) защищенного пентапептида (13) обрабатывают аналогично соединению Ia. Получают 205 мг (46 ) разветвленного пентапептида аналога энкефалина (I ); Peg> + 52 (с. 1; 0,2н. АсЦН); Rf 0,60 (Б), 0,50 (В), аминокислотный состав:

Gly 1,00, Tyr 0,95, Phe 1,26, О п

0,98, Leu 1,05.

Пример 3. Тирозил-(N -аспарагинил)-D -орнитилглицилфенилаланин (Е В)

Р

700 мг (0,73 ммоль) защищенного пентапелтида (14) обрабатывают аналогично соединению I Получают

270 мг (60X) разветвленного пентапептида аналога энкефалина (I ) (К) + 37 (с, 1; 0,2 н АсОН);

Rf p,42 (В); Rf 0,18 (Д),аминокис- . лотный состав: Gly 1,00; Tyr 0,89, Phe 1,13; Orn 0,97; Азп 1,09.

Пример 4. О-ди-трет-бутилоксикарбонил-тирозил-N -(N-бенэилоксикарбонил-пролил)-D-орнитил-глицил-фенилаланинамнд (15).

К раствору 0,50 r (0,54 ммоль) соединения (12) в 3 мл ДМФА добавляют

0,08 г (0,54 ммоль) аммониевой соли

L-окси бенэотриазола и O,ll г (0,54 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь оставляют на ночь, отфильтровывают и обрабатывают аналогично соединению 4. Получают

0,46 г (91X) запищенного амида пентапептида 15 с Rg 0,48 (А."Мерк").

Тирозил-(N -пролил)-D-орнитилглицилфеиилаланинамид (I )..

К 0,28 r (0,30 ммоль) защищенного пептапептида (15) в 20 мп метанола, 2 мл АсОН и 0,5 мол воды добавляют палладиевую чернь и гидрируют в течение 2-3 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме над гидроокисью калия, Полученный продукт растворяют в 5 мл 70 раствора TFA в хлористом метилене,и выдерживают в течение 30 мин. Раствори5 тель отгоняют и остаток растирают в с эфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают, повторно промывают эфиром и сушат в вакууме. Полученный продукт очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке

Zorbax:Ñ . Элюирование осуществляют смесью этанола и 0 1 М раствора ацета та аммония 5:95. Соответствующие фрак ции собирают и лиофилиэуют. Выход

90 мг (50X) разветвленного амида пентапептида (I ); Я +20 (с.l;

:: 0,2 н АсОН); Rf 0,53, (В), 0,22 (В, "Мерк"), аминокислотный состав, :

Tyr 0,86; Gly 1,00; Phe 0,91;

0m 0,92; Pro 1,08.

Проведены испытания биологической активности описываемых соединений (в î).

25 Анальгетическую активность определяли .по методу Н.Ueda et. al.

В работе были использованы беспородные мыши-самцы массой 18-22 r.

Исследуемое вещество, растворенное в стерильном физиологическом растворе, вводили при помощи У-образной иглы в

cisterna mague мозга неанестеэированным мьпиам в количестве 10 мкл. Исследовался диапазон доз от О,25 до. !

О мкг/животнсе для (I ), от 0,25 до 100 мкг/животное для аналогов энкефалина (Р) и (I>) и от 0,05 до.

0,5 мкг/животное для (Е ). Контрольным животным вводили 10 мкл стериль4 ного физиологического раствора. При внутривенном введении препарат вводил.ся в хвостовую вену мьппей в диапазоне доз от 10 до 100 мг/кг(для соединения Е® от 15 до 25 мкг/кг). Каж45 дая экспериментальная группа состояла из 8-10 мьппей. Анальгетическую активность оценивали по методу Buescher при помощи артериального зажима, накладываемого на основание хвоста. Определение болевой реакции проводилось через 5,15,30,60 и 90 мнн после введения и затем каждые 30мин до исчезновения анальгетической реакции.

Результаты выражены альтернативным методом (процент мышей, показавших анальгетическую реакцию). При вычислении КД ; (эффективная доза исследуемого вещества, которая вызы10

Та блица I

Анальгетическая активность энкефалинов при интрацистернальном введении :мышам (метод "tail pirch") Продол- Относительжитель- ная анальность гетическая анальге- активность эии,мин морфина

Соединения

E so i ммоль/животное

Время максиально о эффекта, мин (I ) Tyr-DOrn-Gly-Phe

Я

Рг о- (I ) Tyr-DOrn-Gly-Phe

Ьеи -) (I ) Tyr-D0rn"G1ó-Phe

Азп « (Е ) Tyr-DOrn-Gly-РЬе))Н

„.3

Tyr-DArg-Gly-Phe-Leu

Leu-энкефалин

Met-энкефапин

Морфин

О, 8 (О, 5-!,3) 5-30

0,6 (0,4-1,0) 5-15

1,5

2,0

0,6(0,3-1,8) 5-)5 ) 80

2,0

0,2(0,09-0,4) 5-30 90

6,0

5,2(2,9-9,2)

174(102-281)

154(90-26))

1,2(0,6-2,2) 0,23

0,007

0,008

5

5-15

60 ч при ЕД >е,р

t I

) Данные по активности (ЕДд приведены иэ литературного источника (3) °

I 11669 вает анальгетический эффект у 50Х подопытных животных) использован метод Литчфилда и Уилкоксона.

Анальгетическая активность иссле5 дуемых соединений приведена в табл.) и 2.

Синтезированные аналоги энкефалина с разветвленной пептидной цепью (I -I ) обладают выраженной анальгети10 ческой активностью. Максимальный эффект наблюдается иа 5-15 (I,I ), В II либо на 5"30 мин (I I ) после введе" ния.. Анальгетическая активность аналогов (I -3 ) значительно превышает

15 активность природных энкефалннов .(соединения 6,7 в таблице I) активность (Б Arg )-Leu-энкефалина (соединение 5, табл,1). Анальгетический эффект новых аналогов энкефалина (I -I ) а» 3 в 1,5-2 раза и (I ) в 6 раэ выше анальгетического эффекта морфина в молярных соотношениях при интрациетер.нальном введении мышам (см.табл.))e

По продолжительности анальгетического действия соединение I превосходит морфин в 3 раза, соединение Е - в 1,5 раза, В отличие от природных энкефалинов и от соединения, взятого для сравнения, 0 эти аналоги активны при внутривенном введении (см.табл.2). Аналоги энкефалина обладают анальгетической активностью в интервале от 18 до 697. аналь-. гетического эффекта морфина при внутривенном введении мышам.

Сравнение терапевтических индексов и широты терапевтического действия описываемых соединений (таблицы 3 и 4) с теми же параметрами их ближайшего структурного аналога. Tyr-DArg-Gly- .

-Phe-Leu показывает, что описываемые соединения малотоксичны и превосхо; дят известное соединение по широте терапевтического действия и терапевтическому индексу при интрацистернальном введении мышам.

Описываемые соединения проявляют,.

% высокую активность при внутривенном введении мышам, известное соединение,взятое для сравнения, при таком,способе введения неактивно.

Проведенные исследования показали, что описываемые соединения малотоксичны и превосходят по анальгетической активности известные соединения, при этом нх активность сохраняется и при внутривенном введении.

1116698

Та блица 2

Анальгетическая активность энкефалинов и его разветвленных аналогов при внутривенном введении мьпиам (метод "tail pirch") ЕД ммоль/кг

Относительная анальгетическая

Продолжительность

Соединение анальгезии йри ЕДб й>, мин актив" ность морфин

100Х

60

30

30

26(17-40)

18(15-22) 60

69

100

Та блида 3

Терапевтический ин описываем к аналогов эякефалииа

КД бря литра пистернапьном введении ююааа ерапевтяеский яяекс

ЕД прн внутривейном. чведеяяи

NHOfeN

Соеди" пени рапевтический индекс рмула соединения ммоль/вив. мкг/яив мкмоль/кг иг/к

0,6

Oi8 т

0,5

О,б

Е01

0 5

О,б

0,15

0,2

3 ° 4 .>5 6 (— -) Не дей

20 а1

3,4 ствует

5,2

"Доза пентина (мкг/кчвотное), которая ене ие вызывает токсических эффектов и смерти вивот" иык, следовательно, терапевтический нядекс (ТИ ) составляет величину больную, чем приведенное в ".аблипе отноиеиие, что достаточно дпя.создания терапевтического средства.

Доза пептида, выэываюная смерть 202 кивотных

Доза пептида, еще не выэываюяая токсяческих эффектов, следовательно ТИ больие, чем приведеяEE иое соотноиение

1!Доза пэптида, вызывавшая смерть 402 кивотяых, следовательно ТИ больие 10,2.

51

Доза пептигл, вызывающая смерть 502 кивотиых, следовательно ТИ составляет 12,5.

I Tyr-D0rn-Gly-Phe

Pro

I Tyr-D0rn-Gly-Phe б

l.aE1

I Tyr-D0rn-Gly-Phe

Азп

I Tyr-DOrn-Gly-РЬеНН L

Рго

8 Морфин

Ty r-OOr nW1y-Phe

Pro - тут-LOrnWly Phe .J

Ту r-ООтп-О ly-Phe

Аэп «

Tyr-90m-C ly-Phe-NH

Pro -

Соединение дпя сравяення

Туг-РАтй-О ly-Phe-Leu

73(58-91)

10!(60-173)

32(21-49) >!6 6(— )

lO !)

0,6 э200 (— -)"

100 „

0,5 200 (— ")

100.1

0,%

>16,6(й1-) 5S . >10,9(— -)

800 1) р16(-25)

20 . 12,5(22Я) 1

l3!!!6698

Т а б л и ц а 4

Терапевтическая широта действия описываемых аналогов энкефалина

Терапевтическая шиТерапевтическая широта

Соединение рота

Х4

0,25

0,25

0,1

0,05

0,5

Доза пептидов (мкг/животное), которые еще не вызывают признаков токсичности, следовательно, терапевтическая широта (ТШ) превьппает приведенные

I в таблице отношения.

2)

Доза соединения !1, вызывающая смерть 203 животных„

) Максимальные исследованные дозы, которые еще не вызывали токсических эффектов, следовательно, ТШ превышает приведенные отношения.

y)

Доза соединения, вызывающая смерть 30Х животных

5)

Доза соединения I r, вызывающая смерть 50Х животных.

Минимальная доза вызывающая анальгетический эффект при интрацистернальном введении мьппам /мкг/животн.

>40 (—.— )

10 <)

0,25

) 400(— — )

l 00 4)

0,25

>1000 (— -)

l 00 )

О,!

) 50(-ь- )

25 4), 0,05

40 (— ")

20 й)

0,5

Минимальная доза, вызывающая анальгетический эффект, при внутривенном введении мьнпам, Mr/кг

12(600 ) ) 50,0(600) ) 60

>26(400) 5)!

6 6(250)!

I 1 I 6698

Ига

Н-Х

1=Pre (l f,leu(I+/, Asu(I / Ptu, Phe-ИН,() д а / сн @аЯ g- с нздриазтяа дачикяиексапкарЫойт4 го тур д-Огп ау Рье ИН у

aors/ ЕР акела еантэа анатеаа энкефаннна (I а-1е/

Техред Л Олийнык

Редактор С.Титова

Корректор М.Максимищинеп

Заказ 4358 Тираж 318 Подписное

ВЛИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101