Способ определения активированных нейтрофильных лейкоцитов

 

Изобретение относится к гемоцитологии. После инкубации с нитросиним тетраэолием в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов смесь облучают монохроматическим светом видимой части спектра с длиной волны 460-490 нм, далее удаляют возбуждающее излучение оранжевым светофильтром с пропусканием в области 520-700 нм и по наличию люминесценции клеток определяют активированные нейтрофильные лейкоциты . Способ позволяет повысить точность определения в среднем в 4,8 раза, ошибка в среднем составляет 2,5%. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„Я0„„1394128 A 1 (51)4 С 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ!!3 „ г» с

Н АBTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3765029/28- t 4 (22) 18.07. 84 (46) 07.05.88. Бюл. Р 17 (71) Кубанский государственный медицинский институт нм. Красной Армии (72) А.А.Славинский (53) 615.375 (088.8) (56) Park В,Н, et al. Lancet, 1968,2, р. 532-534. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВИРОВАННЬ1Х НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ (57) Изобретение относится к гемоцитологии. После инкубации с нитросиним тетразолием в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов смесь облучают монохроматическим светом видимой части спектра с длиной волны 460-490 нм, далее удаляют возбуждающее излучение оранжевым светофильтром с пропусканием в области 520-700 нм и по наличию люминесценции клеток определяют активированные нейтрофильные лейкоциты. Способ позволяет повысить точность определения в среднем в 4,8 pasa, ошибка в среднем составляет 2,57., 2 табл.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1394128

Изобретение относится к гемоцито1 логии и может быть использовано в reI матологии, иммунологии, хирургии, те рапии, педиатрии, фтизиатрии, при ин фекционной патологии для оценки функционально-метаболическо о состояния нейтрофильных лейкоцитов с целью диагностики бактериальных инфекций.

Целью изобретения является повы10 шение точности способа.

Сущностью изобретения. является возбуждение люминесценции в цитоплазме активированного нейтрофильного лейкоцита монохроматическим излучением видимой части спектра с дли ной волны 460-490 нм с последующим измерением интенсивности люминесцен" ции активированных нейтрофилов (ИЛАН) фотоэлектрическим или другим объективным методом, Предлагаемый способ основан на открытом явлении: после инкубации с нитросинмм тетразолием (НСТ) в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов при 25 облучении их монохроматическим светом с длиной волны 460-490 нм возникает интенсивная собственная люминесценция, не связанная с содержащимся в клетках формазаном. Люминесцируют только нейтрофилы, составляющие НСТ в формазан. Способностью восстанавливать НСТ обладают активированные стимулирующими факторами нейтрофилы. Клетки, не восстанавливающие НСТ, не люминесцируют ° Это позволяет считать доказанным, что люминесценция возникает именно в активированных нейтрофильных лейкоцитах.

Свечение выявляется в нейтрофилах, содержащих.в цитоплазме не только

40 глыбки и крупные гранулы формазана, но и мельчайшую "пылевидную зернис.тость, которая в известном способе вовсе не учитывается. Отложения формазана в цитоплазме нейтрофилов сами по себе не светятся", люминесценция локализуется в участках цитоплазмы, свободных от формазана. Таким образом, в предлагаемом способе критерием степени активации нейтрофильных лей- 50 коцитов является интенсивность люминесценции клетки, а не количество формазана в ней.

Для возбуждения люминесценции в качестве источника света можно при- 55 менять как ртутную лампу сверхвысокого давления ДРШ 250-3, так и галогенную лампу К111-9-70, обладающую непрерывным спектром. ИЛАН несколько возрастает при изменении длины волны возбуждающего света от 460 до 490 нм (табл. 1).

Пример. Берут каплю крови из пальца больного С. Диагноз — ожоговая болезнь, осложнившаяся сепсисом. Каплю наносят на предметное стекло, добавляют 1 каплю гепарина (10 ед. в

1 мл физиологического раствора), смешивают с 1 каплей 0,1 -ного раствора нитросинего тетразолия в дистиллированной воде, рН 7,0. Проводят инкубацию в термостате 15 мин при 37 С, затем 15 мин при 20 С. Удаляют излишек инкубационной смеси, высушивают препарат на воздухе.

Для измерения ИЛАН помещают препарат на предметный столик микроскопа — цитофлуориметра "Люман-ИЗ" с фотометрической люминесцентной насадкой

ФИЭЛ-1. Освещают препарат сверху через опакиллюминатор и объектив по методу светлого поля. Устанавливают возбуждающий интерференционный светофильтр с максимумом пропускания

470 нм и полушириной полосы пропускания 8 нм. Устанавливают "запирающий". оранжевый светофильтр с полосой пропускания 520-700 нм. Наносят на препарат каплю нелюминесцирующего иммерсионного масла, наводят люминесцентный объектив, апертура 1,25.

Цитофлуориметром измеряют интенсивность люминесценции 50 нейтрофильных лейкоцитов. Регистрацию анодного то" ка фотоэлектронного умножителя ФЭУ-79 осуществляют цифровым измерительным комплексом P 385 К, в состав которого входит вольтфарадоомметр P 385.

Результаты измерений через транскриптор Ф 5033 и блок связи Р 385 К фиксируют цифропечатающей машиной ЭУМ23Д. Полученные индивидуальные значения интенсивности люминесценции 50 активированных нейтрофилов складывают, делят на 50, получают в пересчете на одну клетку значение ИЛАН

3, 08 о тн, ед., что диагностирует наличие септического процесса (бакте- риальной патологии), так как ИЛАН более 3, 0 ед.

Проведены измерения интенсивности максимума в спектре люминесценции активированных нейтрофилов при различной полосе пропускания "запирающе го" св е тофиль тра, Результаты представлены в табл.1.

1394128

Таблица! в 4,8 раза способом.

В табл.

Полоса про пускания

"запирающего" светофильтра, нм

J. параметров излучения.

При Л одаб=

При Л о 5

490 нм

460 нм

Таблица 2

Длина волны возбуждающего излучения, нм

Интенсивность мак10

4,7

350-520

520-700

700-900

3,2

41,9

50,2

400

20,6

0,0

0,0

420

35 8

41,9

460

50 2

490

Интенсивность максимума в спектре люминесценции, %

Примечание. Л вЂ” длина волны воз5о б буждающего излучения.

Как видно из табл. 1, полоса про20 пускания запирающего светофильтра

520-700 нм является его оптимальным параметром как при длине волны возбуждающего излучения 460 нм, так и при 490 нм.

Точность диагностики лабораторного теста характеризуется количеством истинных (т.е. соответствующих состоянию обследуемых пациентов) реэульта30 тов, а также диагностической эффективностью теста случайных ошибок измерений.

Предпринято измерение ИЛАН в сравнении с визуальной оценкой НСТ-теста в четырех мазках крови (двух здоровых людей и двух больных сепсисом) опытными микроскопистами "слепым" методом в числе других препаратов.

В каждом мазке измерение ИЛАН и подсчет НСТ-теста произведены по 20 раз 40 повторно. Каждый раз измерению или подсчету в пределах мазка подвергали

100 нейтрофильных лейкоцитов.

При визуальном подсчете ошибка метода (коэффициент вариации) колеблет- 45 ся от 9,4 до 14,3%, составляя в среднем 12,1%. Особенно высока ошибка при подсчете клеток у больных, что объясняется цитологической картиной в этих мазках и связанными с ней субъективными сложностями типирования нейтрофилов. При измерении ИЛАН ошибка ко леблется от 2,0 до 2,9%, в среднем составляя 2,5%. В мазках здоровых и больных людей ошибка сходна. Таким образом предлагаемый способ позволяет повысить точность определения активированных нейтрофилов в среднем но сравнешпо с известным

2 обоснована оптимальность длины волны возбуждающего симума в спектре люминесценции, %

При длине волны возбуждающего излучения менее 400 нм люминесценция практически неразличима глазом. Как видно из табл. 2, наибольшая интенсивность люминесценции наблюдается при длине волны возбуждающего света

460-490 нм. При длине волны 490 нм люминесценция в 2,4 раза интенсивнее, чем при 400 нм. Дальнейшее увеличение длины волны возбуждающего света (более 490 нм) принципиально неприемлемо по следующим соображениям.

Для отделения света люминесценции от возбуждающего излучения, которое попадает в поле зрения микроскопа, подобран "запирающий" светофильтр с параметрами пропускания 520-700 нм, который пропускает в, глаз наблюдателя или на фотокатод ФЭУ только люминесценцию (максимум на 530 нм) и полностью отсекает возбуждающий свет (максимум на 490 нм). Таким образом, максимальный параметр длины волны возбуждающего излучения ограничен минимальным параметром пропускания запирающего" фильтра. При нарушении границы запирающего" фильтра возбуждающим светом последний вносит искажение в свечение люминесценции.

Аналогичным образом параметры самого "запирающего" светофильтра взаимосвязаны со спектром люминесценции (максимум 530 нм, правое "крыло", плавно спускаясь, доходит до 700 нм, левое — круто спадает к 500 нм). Таким образом, оптимальность параметров

"запирающего" светофильтра определя1394128

Способ определения активированных нейтрофильных лейкоцитов, включающий

Составитель Г.Крюкова

Редактор Г.Волкова Техред М.Иоргентал Корректор О.Кундрик

Заказ 2215/41 Тираж 847 11одписное

ВНИИЛИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5, Производственно-полиграфическое предприятие, r. ужгород, ул. Проектная, 4 ется задачей наиболее полного сохранения света люминесценции при максимальном удалении возбуждающего излу" чения. Нижний параметр (500 нм) определяет разделение возбуждающего света и люминесценции, верхний (700 нм) ограничен переходом видимой части спектра в инфракрасную область.

Формула изобретения инкубацию гепаринизированной крови с раствором нитросинего тетразолия на предметном стекле, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения точности способа, после инкубации смесь облучают монохроматическнм светом видимой части спектра с длиной волны 460-490 нм, далее удаляют возбуждающее излучение оранжевым светофильтром с пропусканием в области

520-700 нм и по наличию люминесценции клеток определяют активированные нейтрофильные лейкоциты.