Штамм актиномицета frаnкiа sp.для получения препарата, стимулирующего рост облепихи
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
: (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ASTOPCH0MY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4170945/31-13 (22) 30.12.86 (46) 15.09.88. Бюл. I(34 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) О.С.Ступарь, С.Н.Новик и А.IO.Òoìàøåâñêèé (53) 576 ° 8 (088.8) (56) Perinet P., Brouillete J.Ñ., Fortin J.À. Lalonde И. Large scale
inoculation of actinorhizal p1antswitli Frankia. Plant and Soil., 1985, ч, 87, р, 175. (54) IlITA5% АКТИНОМИЦЕТА FRANKIA SP.
ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО РОСТ ОБЛЕПИХИ (57) Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использо(511 4 С 05 F 11/08, С 12 Г1 1/20//
//(С 12 N 1/20, С 12 R 1:01) вано в лесном и плодовом хозяйстве для стимуляции роста облепихи азотфиксирующими актиномицетами рода
Frankia. Цель изобретения — получение штамма Frankia sp., обладающего более высокими инбекционностью и стимулирующей активностью роста облепихи. Итамм актиномицета Frankia sp. выделен из корневых клубеньков
Shepherdia argentea и депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ИБФМ AH CCCP) под номером
Ас-1097Д. Применение препарата, полученного на основе штамма Ас-1097Д, обеспечивает 100Г-ное образование азотфиксирующих клубеньков на корнях облепихи и ускорение роста Э-месячных растений в 1,9 раза. 1 табл.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в лесном, плодовом хозяйстве для стимуляции роста облепихи путем инокуляции растений изотфиксирующими сим,биотическими актиномицетами рода
iFrankia. !
Цель изобретения — получение нового штамма Frankia sp., обладающего
1 более высокий инфекцианнастью и сти мулирующей способностью роста облепихи °
Штамм Frankia sP. выделен из корневых K f)pHBKoB Shepherdia arpentea и депонирован во Всесоюзный коллекции микроорганизмов при ИГФМ АН СССР под номером Ас-1097Д.
Штамм Ргап1с а вр. ВКМ Ас-1097Д меет следующую характеристику, 20
Культурально-морфологические признаки.
В погруженной культуре на среде
С-1 (КН РО 0,15 г/л, NaH ГО 0,.1 г/л
8804 0«! г/л КС1 О 1 г/л, Трип- 25 ан (Difco) 2,5 г/л, уксуснокисый натрий 0,5 г/л, Твин-80 1 мл/л, ода дистиллированная 1 л) при вью ащивании при 29 С без перемешивания бразует рыхлые колонии, которые пос- 30 е трех недель выращивания срастаютя, образуя сплошной "ковер" на дне ультивацианного сосуда.
При выращивании на агаризованной,. (1,5 ) среде аналогичного состава астет под поверхностью агара, возушного мицелия не образует. При микоскопическом исследовании наблюдатся отдельные воздушные гифы. Колойия« видимая невооруженным глазом, образуется на 14-18 день инкубации
При 29 С.
При выращивании в тех же условиях на среде с прапионатам в качестВе единственного источника углерода (КН РО 0,3 г, Nal> 0,2 r, М8$04 0,2, СаСОэ О,t r, %qN0 О,! г, пропианат Na 1 г, Н О дистиллированная 1 л) имеет аналогичный характер роста. При исключении из среды источник азота (И! ЯОэ) рас-50 тет крайне медленно. Штамм ВКМ Ас-1097Д образуют хорошо раввитый мицелий в погруженной Культуре, воздушный мицелий отсутствует., Гифы 0,8-1, 2 р м в диаметре. На 55 5-7 день выращивания образует спорангии размером 30-80 pм с неподвижНыми спорами. Споры округлые размером 50 2 1,2-2 р м, поверхность спор гладкая. При выращивании на богатой (ОС-1) среде образует небольшое количество сферических везикул 3-4 р м в диаметре, на бедной среде (без минерального и органического азата) число везикул резко возрастает (В 100-200 раз). Физиолого-биохимические признаки. Наблюдается рост штамма на перечисленных средах в диапазоне температур 10-42 С с оптимумом при 29 С, рост при температуре свьппе 45 С отсутствует ° Оптимальная среда для вы-, ращивания следующего состава: Г,«НРО 0,15 г/л, NaHgP0< 0,1 г/л, МНЯО 0,1 г/л, КС1 0,1 г/л, Триптон (Difco) 2,5 г/л, уксуснокислый натрий 0 5 г/л, Твин-80 1 мл/л, Н О дистиллированная 1 л. В качестве единственного источника углерода способен испольэовать рамнозу, фруктозу, сахарозу, глюкозу, арабинозу, не использует ксилозу и маннит. Хорошо усваивает аммонийный и нитратный азот, а также органические источники азота, такие как гидролиэаты белкой, дрожжевой экстракт, глутамин. При отсутствии азота в среде способен восполнять дефицит за счет фиксации атмосферного азота, для чего образуются специфические структуры— везикулы. Уровень ацетиленредукции в указанных условиях составляет 8- 12 нМ этилена/мг белка.ч. Специальных факторов роста не требует. Склонен .к микроаэрофильнаму росту. Колонии бесцветные, может образовывать растворимый пигмент с индикаторными свойствами (при рН 6,8 желтый, рН 7,8 красный) в старых культурах. Не образует антибиотиков. Стимулирует образование азотфиксирующих корневых клубеньков у облепихи, ак" тивно фиксирует атмосферный азот. Штамм хранят при 5-7 С на среде ОС-1, пересевы на свежие среды проводят раз в 4 мес. Может храниться в 10%-ном глицерине при температуре о -20 С и в лиофильно-высушенном состоянии с обычными криопратекторами (сухое молоко, сахара-желатиновый агар) не менее r. При этом свойства штамма устойчивы. Получение и применение препарата штамма актиномицета Frankia sp. ВКМ Ас-1097Д. Пример 1. Штамм актинамицета выращивают на среде ОС-1 при 29 С 1423550 Штаммы Frankia I Показатели SCN 10a (известный) Неинокулированный контроль BKM Ас1097Д, (предлагаемый) торф-песок торф-песок 2:1 2:1 Субстрат д о ° Количество растений Средняя длина стеблей, см 17,5+0,8 6,5+0,4 9,2 Максимальная длина стебля, см 13 31 в течение 21 сут в стеклянных колбах Эрленмейера объемом 500 мл (объем среды 200 мл) беэ перемешивания. Биомассу актиномнцета отделяют от культуральной среды фильтрованием через бумажный фильтр и взвешивают. Гомогенизацию биомассы проводят в физиологическом растворе (0,85X NaC1) с помощью стекляного гомогениэатора Поттера с те@лоновым Ф поршнем (100 мл раствора на 1 г сырой биомассы) или пяти кратным пропусканием суспенэии через шприц "Рекорд" с иглой 1А1-0860. Необходимые разведения проводят в аналогичном растворе. В горшки с перлитовым песком вно.сят питательную смесь следующего состава, г/л: К S04 0,11, МгS04 0,1, Ca(H 0,014, НаМо04 .2Н<0 0,025, В каждый горшок вносят 15 семян облепихи. Поливают ежедневно водопроводной водой. Через 1 мес. в горшки вносят 20 мг чистой культуры штамма Frankia sp. ВКИ-Ас-1097Д, полученной предлагаемым способом. Через два месяца трехмесячные растения имеют следующие параметры: средняя длина стебля 11 0 0 5 см, растений с клубеньками 100Х, количество клубеньков в среднем на растении 5,2+1,5, объем клубеньков 0,05 см, ацетиленредукция 0,5 смоль С Н4/ч. Контрольные (беэ инокуляции) растения (46 экземпляров) -имеют следующие параметры: средняя длина стеб- ля 6,5+0,2 см, растений с клубеньками — О, ацетиленредукция — О, Пример 2. В горшки, содержащие торфо-песочную смесь (2: 1) вносят 20 мг чистой культуры штамма Frankia sp. ВКМ 1097Д, полученной предлагаемым способом. В горшок высевают 25 семян облепихи, поливают ежедневно водопроводной водой. Через 3 мес. растения имеют следующие биометрические параметры (в среднем на 1 растение) длина стебля 17,5 см, растений с клубеньками 1007., количество клубеньков 2,2, объем клубеньков 0,19 см, общий вес растения 1,7 r. Ацетиленредукция 2,1 моль С Н4 в ч. Контрольные (беэ инокуляции) растения имеют следующие параметры: длина стебля 6,5 см, растения с клубеньками О, общий вес рас20 тения 0,4 г. Результаты сравнения влияния на облепиху предложенного и известного штаммов представлены в таблице (стимуляция роста облепихи при инокуля25 ции чистыми культурами, данные средние на 1 растение). Сравнение штамма Frankia sp. ВКМ АС-1097Д со штаммом Frankia sp SCN 10а (1) показало, что штамм BKM 30 АС-1097Д обладает более высокой ин=фекционностью и стимулирующей способ-. ностью роста облепихи (уровень инфекционности возрос на 26Х, а средняя дпина трехмесячного растения в 1,9 раза. Фо р мул а и з о бр е те ни я Штамм актиномицета Frankia sp. ВКМ Ас-1097Д для получения препарата. стимулирующего рост облепихи. 1423550 Продолжение таблицы Показатели Штаммом Frankia I 100 Данные от- 1,7 0,3 0,4+О,1 сутствуют Количество клубеньков То же 2,2+0,6 0 0,19+0,03 0 Объем клубеньков, см 2,140,1 0 Составитель A. Кураков Техред А.Кравчук Корректор М.Васильева Редактор И. Сегляник Заказ 4604/28 Тираж. 425 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Инфекционность, Е Вес растения, r Лцетиленредукция (p моль С2Н /час) SCN 10 (извес ный) BKN Ас1097Л, (предлагаемы ) Неинокулированный контроль
