Штамм в-лимфоцитов человека, используемый для получения гибридных культивируемых клеток человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения гибридных клеток человекЭо Целью изобретения является получение нового В-лимфоцитов человека, устойчивого к 5-бромдезоксиуридину (5-БДУ) и используемого в гибридомной технологии. .1 НСИ. TK .6410t получают индуцированием к дифференцировке исходного штамма RPM1-6410, Штамм резистентен к 5-ВДУ в концентрации 25 мкг/мл, что связано с дефектом по гену тимидинкиназы. Модальное число хромосом 2п 47, ХУ (В стабильных маркерных хромосом), Клетк1 : штамма НСИ.ТК. 641 Ot не секре-- тируют в ростовую среду иммуноглобулины , а также их свободные тяжелые и легкие цепи. При слиянии с периферическими .гп мфоцитами крови человека клетки штамма образуют иммортализованные гибриды, стабильно продуцирующие 1 g. 1 табл. to

(5П 4 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕтения

-l А TGPGHO1ViV СВИДЕ7 БЫ . ПВУ

ГОСУДАРСТВЕККЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕГ1АМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЬ!ТИЙ (21) 4222201/3I-13 (22) 03.04,87 (46) 15,!1.88„ 1.... Р 42 (71) Институт био:tQгHH развития им. H.К,Кольцова (72) Т.М,.Серегина, Г1.И.."..екюенков и Т,В,Катковская (53) /8 085,23(088.8) (56) Заявка PCl - 83/00503, кл. С 12 N 5,/00., 1983, (54) Ь ТАЬМ В- ПР1фОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ИСПОЛЬЗУЕ%2 ДЛЧ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЬ:Х

КУЛЬТИВИРУЕЮэ Х КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотех-нологии и может быть использовано для .-. олучения гибридных клеток человека. Целью лзобретения является получение нового штамма В-лимфоцитов человека, ус-.ойчивого к 5-бромдезоксиуридину (5-БДУ) и используемого в гибридомной технологии. Штамм НСИ.

ТК .6410 получают индуцированием к дифференцировке исходного птамма

РРМ1-6410. Штамм резистентен к 5-БДУ и концентрации 25 мкг/мл, что связано с дефектом по гену тимидинкиназы.

Модальпое число хромосом 2n = 47 >

ХУ (8 стабильных маркерных хромосом), Клетки п|тамма НСИ,ТК .6410с не секретируют в ростовую среду иммуноглобулины, а также их свободные тяжелые и легкие цепи. При слиянии с периферическими лимфоцитами крови человека клетки тамма образуют иммортализованные гибриды, стабильно продуцирующие 1 g. 1 табл.

1 1! ) 7 3 <> 7

Изобр<ятение QTHocè(c>> к (>и Отек,3<, лсгии и может быть испол: зовя но д.)г п<0<1) ((Br(Jr# T иб1>идных клет< > к ч(. (ОВ = (я .

L)cirr, изобретения — Jr(::.уче>(>(е )!:г о. .О штамма(<)-лимфоцито)в ч-: ланс -„=.„ .,с— or:;.÷)B0го -с 5-бромдезокс ->гон,;.(цу и и с ц Ол ь 3 у Р ".(О (o .3 Г" ) T T6) p ((Д О <и .", Й т Р к << 0"логии.

Ц)->Я>1), <ПО ц<) ..„-)ю;- с) > е<< у(3)>;(()брав < r,;, ) (9

Ис 04((! IJ(0(! поцуче:-„>)я тям (B сл-—

>)ц)л> (()так(м -(Р.".; - 0(<1()) уст (Он)<{.цl:ый

>з 1<9<)73 1, из перцферичес::-":рови (>r<, .-,TiL ц((< Ос ) ) Ой 1 <(и ел 06; <,:,, Гной и; >—

l",c:>(те>1. (;Ят(зтки B гQ) Q )))та(. !;I инду(,":(руют ";,и:<яферец).;,";poB <е - г) :,. г< куль ..."ВИП 0>B>3) ИЛЕ(f g ОЕДР . ОПЕ,>)<;)К(!Е ".- И ,(t >TT(I O P Ц; l Я! -< Н Т 3 Р (f 3,>)G ,i!> «B0i ..) (O J1)3 II >T) 0(3k! >(bJ ", "; «>!> > ; i r ;> I > (TTT(1OC l("30. 3,)>Рй(С Тн(.(я И >,; T C! B I .. ;. r ">!:

:(Tq Отм»(J! )(<) г н c T)p. T> r. и >< > ) \ 1 ((> ц <, : .Г ЕДЕ (l КЛОНИ!)у>от: Етод 0 (1):,.Iã.-п Ь) iK

: ".:НЕГ(ел<-:й „ <(О> > ЕЧС;B. )> <:>, .(To-:>0Í.

» »- 0)КР->(! ).(T П(-,ЦЕ). -.,PI> .—;" . ;-O )(Г;С

r TTB > TTЯ-,. >(I B>rI(!B 1> r I — (><>>, . I !; (, „,";- »! r > >

; < . С>BKT)еци(r) (.Г, ><1, Т. -:", >! Jl

> < -> -.. .П » .. <т » .->") » >э )(Р Tf ..,!(I ; ;,..,,,) » )-,>(.>

l;(е ; )п)м )(() сдс ) (,-.1(1 Л l и !

> П< >l(r) B T» >J! ) T)Е If: () i i!:ËB Ò(r ",> l> J> .".< > I (: (-. >>1

).Л<->Ц, > В (>ò !))!P BК ( (-,/< (i1 i f((< 1-.;;.; )(и-><)r) TTT;:,;. c ) (ну.". среду иь. ; цоглобупины, . :::. ц I "=

1< (TB TT (ц»:3(<з> fh)P..П <:„- пц i> (>7>- с, с : >Brl > -) >- > r, . цоц рек.)>зниру<нт,, суг: r>)JB::!:т:roc!

> )<ц<-, тсст)(р,т(()т -(а Q ) C Ã! с ! f c r екр >i(T)p

1- ró)>T(TrOт,утобуЛИПО)„Н П )O)T(T<. ." ПС>лj>r:- IJI!

-ЧР>., »>Ь>)< <(>та>> .! Н Тr T)C ц>!:,I (i Jr) >С<. я",ц) . —;.—,,ЛЬ Ин((РУЮТ Н < Р- >>Е .* 0>T! ...:(T:1(;)!I;Е J t ,.(>;" I МЛ О-б ОО> (ДЕЗОКС! "У" »>) .Ц вЂ” - . ->.!

>>< "11 т (Г 7 i !)

r(Он;, (-,„-тря))т(и -;--1>)",:,У н,;>ст<. Вои (P T> TT> PB>3И<" тЕ)()T)OC - J > :" (<.)3)r B - )IB с. до<1)екто.",! по T,:,ну;<1))<)Д) I (>)!,:.. B L) (> (,;), B TQ Q6 сл, ) (алин с(РТ гибРT! "ü .;,! j ет(. к <) (,, J . Ыi1 OÃ н с<а;(екти<нно)) с; ц-. 0 t>)p

Птамм хранится B Специ. (Низ) poBG if"

5 ной коллекции г(еренинаемь)м соматичесKHX K)IeTOK ПОЗВОНОЧНЫХ )))! Та <.,ИТОПО " гии АН СССР под номером 9:7Э и харак-теризуется следую(()ими при:>>накями.

Морфологические признаки. Б стандартных условиях нырап инания клетки растут в виде скоплений, снободной плана)о!цих в купьтуральной среде. (!)Ормя. к.(сто- црси fуцес".))евно крчгпая. ! (J 0 (frJI I! .: (3 "") Я - 11 >IE (>;>)»лn " .o (11-: r> c )<ие rrpи н яки . "1oдяль" цо» )цспс хромосом 2п = . 7> Х 7. 1(я- -">)Вя . З ">Br!<)I ВСС..-И -, -- ;7:1ри Tr B" <

;: > .т; пиров Яцик 73 >Йд-.-нo ! яб)(3цьц(: х:" я : керных хрсм< с(>м, } . > :) Ь Т > Г) Яц, (:! J r-. -: Ц -T C > Ь; Я: (—,, B ) К t

:;;;;)Имя р; с гут в сус .Сцз«и в С.<ек.::ян—

I!<>Й i . ля.с г) ;<О зс>:! ку. > т>,ря;)ьffой по" суде. liBC сиро «я)-иo (.)е". Ск lpÎilз)roдят

p B B б Я Б 1 е н и (-. ": . ус и ц з и и с в е)к е Й c p ел ОЙ

-((«p0B 96-ч:lco:)ые Интервал>, i;..")се >цая

:o=- а к:)еток и,)(! . :у>:ь тини; нации в

:-.ц ярт-:i>(õ у; .)Они„)х сеген.цяез

„, я к.> ° е Ок >!Я I >".i ц; .(це>1 ..еу. :ь ! >> !! О:; С > (д(, Tjir > ) )> Г; —,- >< > (Ь-! ): . <3ц:p;Ini!B r<> >(.",(CI>l: n!;<)>т <И " ПЕ:-.КЯ ! -\r f Tf „!, f»! >.)ХО!;и! )Ь(:, (. ((> ((cji",и с:.

>"

2, > !

),) 3)!)! у, ->OC) И. . ПО-.:V- l!I: -.: ..;К

-)р< ".,-;; я,<(,, 1 Я-. 7() T (;.Р< тк!!

;;;, > < !i, ocц;ц.) 1> - ) С! >< >е-! -:; - Я

С Г <)((, б (> ОСТЬ > I C fi >r (Я!(<<)< В ".. J,)) 1B(ДBP .,;-"I>"... угJIODиях >)г)>л); т.! в (()О.! BifHH (Остап,lя е T .3 С вЂ” Я ..>,,, Ц>- >; т>13 ц. О, <>я -(я.Г:я <><» . к> !i—

<(Яцця г!ЯС<. Я;,<.- : ОС тЯНЛя< т 9(, Ч

1аркерць(е ц»и з >)яl<) ., 0 >е 3у.)ьтяг Я!" И()с )Е-IÎBß1(I.R В Е JIPB)".<".."I ИМ:" » ) 0 -,> =- Г ме);;ц)м методо (ИФМ) .(летки !. -(мя (. g !< Р Е - -> Р УК>т l) Р n (т 0 В;> С Р У вЂ” ))М У— (!Оглоб-,.-, .-(кы,,=: —.;-.кже с:обе дные тя)!<сВг. p и л(- T !(l е -(«- и .>:,С.(м>)-0!-. rр >-, ли,— .:он, )(,етки . ст=;-: -, вы к =- 1).. у в

ЦЕПТ„ )Я ЦИИ 2 > МК (./ .;;; К;.:)втУРЯ ->,ff<-,)f ()Р Е (Ы, .Ч < O ЦО 3 Н oi) B r: > И(.ПОЛЬ 3>OB B > Ь дпя се:"(е ((.>))I г)(()риг>,() в, -0. (x чя емьа( ца Основе (>)там. IB 1)<:И. TK . С- . UT .,; е— .)(Рк г)(з) ую сред пА, При (I тогенети Е" 1(or". ".(Ñ Г . ЕД013 > (НИ >) ТЯМ. I Я )Ц BÐË C Jr

Б маркерных хромосом. ,ванные о контаминации микрсорганизмами. >(Онта (инация вирусами, бактериями, гриба)ц), микоплазмами не обнаружена.

Способ проверки жизнеспособнос.-и (l.тамма. KvB>f()c!rncn6)rocòü клеток ((!Т() мма проверяют по вытеснению с мес и

K p B c rr T e. ) ей т р )3 и;! н 0 (3 о 1 0 с и и е (C з

143 на (1:1) при подсчете клеток в камере Горяева.

Способ криоконсервирования. Среда для замораживания: 507. FCS,407. культуральной среды и 107 глицерина. Клет. о ки эамораживают от 4 до -40 С со сКОростью 1 С/мин, от -40 до .-70 С— со скоростью 5 С/мин и затем погружают в жидкий азот. Клетки длительно хранят в жидком азоте. При отогреве о клетки быстро переносят в 37 С и после достижения ампулой этой температуры немедленно переносят в стандартные условия культивирования, Использование. штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Лимфоциты периферической крови (ЛПК) изолируют иэ периферической крови здорового донора в градиенте фиколла. ЛПК собирают из интерфазного слоя, дважды отмывают в среде RPM1-1640 без добавок, затем суспендируют при концентрации

10 кл./мл в полной культуральной среде (ПКС), содержащей 50 мкг/мл липополисахарида из Е.coli u Pokeweed Mitogen (PNM) в разведении 1:100 и инкубируют 48 ч при 37 С, в атмосфере 57 СО ° Обработку PWM и лигополисахаридом проводят для активации

ЛПК и увеличения частоты слияния, 2 10 клеток НСИ.ТК .6410t, находящихся в середине логаримической фазы роста смешивают с 2 ° 10 .ЛПК. Смесь

7 клеток трижды отмывают от FCS, центрифугируя их при 160 g. После центрифугирования супернатант удаляют полностью и к осадку добавляют 1 мл

457-ного (V/V) ПЭГ (м.м. = 4000).

ПЭГ добавляют постепенно, осторожно взвешивая в нем клеточный осадок.

Процедура добавления ПЭГ занимает

1 мин. Еще 1 мин клетки инкубируют с

ПЭГ при комнатной температуре ° Затем к инкубационной смеси медленно по стенке центрифужной пробирки добавляют 1 мл RPM1-1640 и центрифугируют 3 мин при 350 g ° Супернатант тщательно отсасывают, добавляют 1 мл полной ростовой среды, осадок клеток осторожно взвешивают в ней пипеткой и добавляют еще 15 мл полной ростовой среды. Клетки центрифугируют 7мин при 160 g. Супернатант удаляют, клетки ресуспендируют в среде НТ, приготовленной на основе ПКС, инкубируют

2 ч при 37 С, 57. СО . После окончания инкубации клетки ресуспендируют

7392

5 l0

55 в концентрации 10 кл./мл в среде НТ без аминоптерина и высевают на культуральные 96-луночные микроплаты по

0,1 мл суспензии по лунку (10 кл/лунку). Платы помещают в инкубартор при 37 С, 57 СО„. Через 24 ч в лунки добавляют по 0,1 мл среды НАТ. Конечная концентрация компонентов в среде

НАТ составляет мкг/мл гипоксантин

13,3; аминоптерин 0,18; тимидин 12,5; глицин 7,5. Смену 0,1 мл культуральной среды проводят каждые 5-6 дней.

Через 20 дней после слияния иэ среды исключают аминоптерин. Растущие гиб— ридные клоны появляются через 3-4 недели после слияния, частота слияния составляет 47 10 (в пересчете на

10 клеток, участвующих в слиянии).

Контролем служат эксперименты, в которых в 96-луночные микропласты высевают смесь клеток НСИ. ТК .6410t и ЛПК, не обработанную ПЭГ-ом. В этих экспериментах растущих клеток не обнаруживают.

Таким образом, для отбора гибридов клеток человека, полученных на основе штамма НСИ-ТК -6410t, пригодна общеизвестная среда НАТ. Получаемые гибриды иммортализованы и способны сколь угодно долго размножаться in vitro.

Пример .2. Супернатанты от растущих гибридов тестируют на наличие в них иммуноглобулинов (Ig) человека с помощью ИФМ. Для этого в лунки микроплат для иммунологического анализа наносят бараньи антитела к 1- и -цепям Ig человека, очищенные методом афинной хроматографии. Платы о инкубируют 12 ч при 4 С. После удаления раствора антител из лунок, на платы наносят 0,1 М трис-глициновый буфер (рН 8,5), содержащий 17. бычьего сывороточного альбумина и платы инкубируют 2 ч при 37 С. Эту процедуру проводят для предотвращения дальнейшей неспецифической адсорбции иммуноглобулинов, на пластик микроплат. После удаления блокирующего раствора в лунки наносят супернатанты от растущих гибридов. Платы инкубируют 1,5 ч при 37 С. Затем тестируемые супернатанты удаляют, платы

3-кратно отмывают фосфатным буфером (PBS), содержащим 0,17. Tween-20. После отмывки в лучки добавляют коньюгаты антител к - и -цепям с пероксидазой хрена. Платы инкубируют 1,5 ч

1437392 ния гибридных культивируемых клеток человека.

Концентрация Ig, нг/мл

Клетки

Ig М f0

НСИ.ТК.64 10г.

Гибрид 1-5.D7

2300

Гибрид 11-1.С5

3700

Гибрид 11-4.Гб

Формула из обре тения!

Штамм В-лимфоцитов человека ВСКК ,(II) 0920, используемый для получе-! !

Составитель М.Серова

Техред М.Ходанич Корректор С. Черни

Редактор Н. Киштулинец

Заказ 5855/25 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, уп. Проектная, 4. при 37 С. Коньюгат удаляют, платы отмывают 3-кратно PBS с 0,1X Tween-20 и наносят раствор субстрата (4 мг ортофенилендиамина на 1 мл фосфатноцитратного буфера, рН 5,0 + Н,О ).

Платы инкубируют 30 мин в темйоте при комнатной температуре. Реакцию ре гистрируют на фотометре при 492 нм.

Результаты исследований представ:лены в таблице.

Результаты, представленные в таб лице, свидетельствуют о том, что штамм НСИ,TK .6410с не секретирует

Ig в ростовую среду, а при слиянии с ЛПК, синтезирующими Ig, образует иммортализованные гибриды, стабильно продуцирующие Ig.

20 Не превышает неспецифический фон в контроле. Контроль — тестирование ИФМ свежей ростовой среды (ПКС).