Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к пероксидазе хрена

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в иммуноферментном анализе. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, пр-одуцирующего монокло- -нальные антитела (МКА) к пероксидазе хрена, которые обладают повьшенным сродством к стафилококковому белку А. Штамм получают гибридизацией сплено - цитов мьш1ей линии SIL/I, иммунизированных пероксидазой, с клетками миеломы 653,А. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:00000, в асцитической - 1:000000. Ста бильная продукция антител сохраняется на протяжении 46 пассажей in vitro. МКА относятся к классу I gG 2 Ь,они за-- держиваются сорбентом, содержа1Ц11м S Стафилококковый белок А при рН 8,0, а элюируются с него при снижении рН до 3,5. Штамм онкогбнен для мьшей IF /SIL/IXBALB/C). сл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

977 А1 (19) 01) Я) 4 С 12 М 5/ОО А 61 К 39/395

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М А ВТОРСКОМУ СВИДЕТ ЕЛЬСТВУ

laical

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4205405/28-13 (22) 03.03.87 (46) 30.10.88. Бюл. Н - 40 (71) Центральный научно-исследова» тельский рентгенорадиологический . инетитут (72) В.В.Климович, М.П.Самойлович, С.Ф.Пашкова, Н.С.Сирота, Г.Н.Денисова.и В.И.Иелудов (53) 578.085.23 (088.8) (56) Behn I et. al. Miss Z. KarlMarx Yniv. Leipzig. Math-Naturwiss.

R., 1984, 33, 659-662. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ М11Я MUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕИЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К ПЕРОКСИДАЗЕ ХРЕНА (57) .Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в иммуноферментном анализе.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего монокло° нальные антитела (МКА) к пероксидазе хрена, которые обладают повышенным сродством к стафилококковому белку А.

Штамм получают гибридизацией сплено» цитов мышей линии SIL/I, иммунизированных пероксидазой,с клетками миело.мы 653.А. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:00000, в асцитической — 1:000000. Стабильная продукция антител сохраняется на про.тяжении 46 пассажей in vitro. MKA относятся к классу I gG 2 Ь,они задерживаются сорбентом, содержащим Ж стафилококковый белок А при рН 8,0, а элюируются с него при снижении рН до 3,5. Штамм онкогенен для мышей ,F,/SIL/IxBALB/с).

1433977

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в иммуноферментном анализе.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых кле,ток животных, продуцирующего моно клональные антитела (МКА) к перокси дазе хрена, которые обладают повышен ным сродством к стафилококковому бел- 10 ку А.

Штамм получают следующим образом.

Для иммунизации мышей и выявления антител используют препарат пероксидазы хрена с показателем чистоты RZ=

0,3. Препарат в дозе 0,2 мг в объеме

0,05 мл полного адьюванта Фрейнда вводят мышам линии SIL/I подкожно дву" кратно с интервалом 6 недель. На седьмые сутки после второй иммунизации сыворотки животных исследуют на содержание антител против пероксидазы. Спустя еще три недели мьппей, у которых титр антител в сыворотке со"

;ставляет 1:2096, дополнительно имму низируют внутрибрюшинно 0,2 мг перок сидазы в 0,5 мл фиэиопогического раствора и через трое суток получен ные от них селезеночные клетки используют для гидридизации. Партнерами для гидридизации служат клетки мпеломного штамма 653.А, выращенные

1 на питательной среде содержащей модиУ фицированную Дульбекко среду Игла (90 ) и сыворотку крупного рогатого скота (107) . Для слияния используют в „7, 10 клеток селезенки и 5x1v клеток миеломного штамма, смесь которых об,.рабатывают раствором полиэтиленгликоля (50 ) с молекулярной массой 1000.

;Для выращивания гибридов используют 40 фидерный слой из перитонеальных макрофагов мЬ|шей и питательную среду указанного состава, содержащую на

100 мл, мг: аминоптерин 10; гипоксан-. тин 500 и тимидин 500. Дополнительно

45 среду обогащают 107 ростовой среды, в которой в течение пяти дней культивируют клетки штамма 653.А. С седьмого дня после гидридизации нз состава среды исключают аминоптерин, а с четырнадцатого гипоксантин и тимидин.

Для выявления культур,, содержащих гибридные клетки-проценты антител к пероксидазе, применяют тест, основанный на способности клеток эолотис- 55 того стафилококка связывать мышиные иммуноглобулины класса 1 gG, не нарушая их взаимодействия с антигеном.

При наличии в испытуемой пробе антител против пероксидазы они соединяются с внесенным в пробу ферментом, образуя иммунные комплексы, и этим обуславливают фиксацию фермента на стафилококках, благодаря чему последние приобретают несвойственную им в норме пероксидазную активность. Фиксацию выявляют путем проведения катализируемой пероксидазой реакции превращения бесцветного субстрата в окрашенное производное. Интенсивность окрашивания зависит от концентрации антител и от прочности их связывания с ферментом и стафилококками. Выявляют 17 культур, вырабатывающих антитела искомой специфичности.

Среди них для дальнейшей работы выбирают культуру, надосадочная жидкость которой дает наиболее яркое окрашивание при тестировании указанным способом. Клетки этой культуры подвергают клонированию методом лимитирующих разведений на фидерном слое иэ перитонеальных макрофагов мышей.

987 полученных клонов позитивны при тестировании на выработку антител против пероксидазы. Один иэ полученных клонов размножают до массовой культуры и реклонируют, 1007 выросших клонов продуцируют антитела к пероксидазе. Полученный штамм размножают до массовой культуры, на 46-м пассаже с момента получения криоконсервируют и депонируют во Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером 45Д Института цитологии АН СССР.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки в культуре выглядят прозрачными, округлымн, часть их прилипает к поверхности культуральных сосудов. При ухудшении условий культивирования клетки утрачивают однородность размеров и прозрачность, среди них появляются частицы детрита.

Кариологические признаки.

Кариотип клеток соответствует их видимой принадлежности: большинство хромосом имеет акроцентрическую конфигурацию. Модальное число хромосом равно 92 (клетки родительского миеломного штамма имеют модальное число

54). В клетках обнаруживаются 2-3- маркерные метацентрические хромосомы.

Культуральные признаки.

1433977

Стандартные условия культивирования штамма следующие: температура

37 С, воздушная атмосфера при выращивании клеток в герметично закрытых флаконах или атмосфера с 7,57 СО в

5 воздухе со 1007-ной влажностью при выращивании в открытой системе. Питательной средой служит смесь среды

Игла в оригинальной прописи или в модификации Дульбекко (907) и сыворотки крупного рогатого скота (107).

Культура представляет собой взвесь одиночных клеток или рыхлых агрегатов по 4-16 и более клеток, легко раэъединяющихся при встряхивании.

Оптимальная посевная доза — 2x10

5 клеток в 1 мп среды. Для поддержания культуры в пролиферирующем состоянии клетки рассевают 2 раза в неделю с коэффициентом 1:2 — 1:4. Максимальная плотность культуры с сохранением

6 жизнеспособности — 1,4-1 бх10 кле.ток в 1 мл. Для получения содержащей антитела асцитической жидкости мышам- 25 межлинейным гибридам, получившим за

7-15 дней до .прививки инъекцию 0 5 мл пристана внутрибрюшинно, вводят тем же путем 5-10 млн клеток, выращенных в условиях культивирования. Асцит развивается в течение 2-4 недель. его собирают, клетки опухоли отделяют от асцитической жидкости и перевивают новой группе мышей, а жидкость используют как источник антител.

Продуктивность штамма. 35

Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:00000, в асцити" ческой — 1:000000. Стабильная про-. дукция антител сохраняется на протя40 женин 46 пассажей п чего.

Характеристика полезного продукта.

NKA относятся к классу I gG 2 Ь, они задерживаются сорбентом, содержащим стафнлококковый белок А при ph

8,0 а элюируются с него при снижении

ph до 3,5.

На иммуносорбенте, содержащем иммобилизованную пероксидазу хрена, МКА полностью задерживаются при рН 50

8,2. При элюировании глициновым буфером (рН 2,8) с сорбейта смывается не более 307. сорбированных антител, что

> указывает на высокий аффинитет антител к пероксндаэе. В тесте встречной имму-..55 нодиффузии или при смешивании с 1050-кратным избытком антигена видимых осадков не образуется, т.е. антитела не относятся к разряду преципитирующи х °

Контаминация.

Проверка штамма на присутствие контаминирующих микроорганизмов, проведенная на культурах, постоянно выращиваемых без антибиотиков, показала отсутствие бактерий, грибов, дрожжей и микоплазм.

Онкогенность.

Штамм онкогенен для мышей F (SIL/

IxBALB/с).

Криоконсервирование.

Криоконсервацию штамма проводят в среде следующего состава, 7:

Среда Игла 45

Сыворотка крупного рогатого скота 45

Диметилсульфоксид 10

Ампулы со взвесью клеток, содержа6 .щей 1-5х10 кл/мл, помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок о

15 мм, и выдерживают в нем при -80 С в течение 24 ч, затем ампулы переносят в жидкий азот.

Для размораживания клеток ампулы, извлеченные иэ жидкого азота, помешают на 4 мин в воду с температурой

42 С, центрифугнруют при 1000 об/мин

3 мнн, заменяют кривозащитную среду на ростовую и рассеивают, разбавив взвесь до концентрации 3-5х10 кл/мп. Через

24 ч добавляют равный объем свежей ростовой среды и на следующий день рассеивают по 2х10 кл/мл.

Пример 1.. Хроиатографически очищенный иммуноглобулин мышей раст воряют в 0,1 М бикарбонатном буфере с рН 9,5 и доводят концентрацию его до 5 мкг/мл. В лунки планшетов из поливинилхлорида вносят по О, 1 мл о раствора и инкубируют 2 ч при 37 С и

18 ч при 4 С. Затем лунки трижды отмывают раствором, содержащим в

0,015 М фосфатном буфере, Х: хлорид натрия 0,85, желатина 0,5 и твин-20

0,1. В качестве стандарта используют аффинно-очищенные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши, растворенные в буфере указанного состава.

Испытуемые сыворотки кроликов вносят . по О, 1 мл в лунки планшетов и готовят ряды двукратных разведений на буфере, используемом для отмывки планшетов. Стандарт вносят в отдельные лунки. Разведения испытуемых сывороток и стандарт инкубируют в о лунках 1 ч при 37 С и затем трижды

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.

2б ВСКК (П) 11 45 Д, используемый для получения моноклональных антител к пероксидазе хрена.

Составитель M.Ñåðîâà

Техред М.Ходанич

Корректор С.Черни

Редактор М.Петрова

Заказ 5517/28

Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4.

5 143 отмывают раствором указанного состава. Далее в лунки вносят раствор, содержащий моноклональные антитела против пероксйдазы (10 мкг/мл) и пероксидазу хрена (50 мкг/мл). После о инкубации в течение 1 ч при 37 С лунки трижды отмывают и вносят в них раствор хромогенного субстрата. Через

30 мин оценивают результат реакции фотометрически. Оптическая плотность в лунках, содержащих стандарт, составляет 0,550+0,050.

Пример 2. В качестве антигена используют лиофилизированный препарат легких цепей, выделенных из донорского иммуноглобулина человека путем восстановления, алкилирования и последующего отделения легких цепей гель-фильтрацией. Антиген растворяют в 0,1 М бикарбонатном буфере с рН 9,5, доводят его до концентрации 10 мкг/мл и вносят в лунки планшетов Йз поливинилхлорида. Условия сорбции антигена и отмывания описаны в примере 1. Испытуемые сыворотки мышей вносят по 0,1 мл в лунки план3977 6 шетов и готовят ряды разведений на отмывающем буфере. После инкубации в течение 1 ч при 37 С испытуемые

5 пробы удаляют, лунки трижды отмывают, затем в них вносят раствор аффинноочищенных кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши (10 мкг/мл), вновь инкубируют 1 ч при 37 С и трижды отмывают. Далее в лунки вносят раствор, содержащий моноклональные антитела и пероксидазу, а после инкубации — хромогенный субстрат (концентрации реагенов такие же, как в предыдущем примере). Окрашивание в лунках оценивают через 30 мин. Разведение мьппиной сыворотки 1:800 обеспечивает развитие окраски с оптической плотностью 1,755.

Формула изобретения