Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к кератину n17 человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изучения механизмов цитодиффереНцировки в норме и паталогии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животних MUS musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к кератину № 17 человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мьппей линии BALB/C, иммунизированных фракцией промежуточных филаментов, с клетками миеломы X 63-Ag 8.653. Штамм культивируют на среде Игла в модификации Дульбекко с 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Секреция МКА на 5-й день культивирования составляет 5-10 мкг/мл. МКА относятся к классу IgG2b(H). В реакции иммуноблоттинга с кератинами из культуры клеток HeLa и срезов органов человека МКА реагируют одной полосой с кератином м.м. 46 КД(№ 17). ф (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ . ЕЕСПУБЛИН (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4253164/28-13 (22) 3 1.03,87 (46) 30. 10,88. Бюл. Н- 40 (71) Всесоюзный онкологический научный центр АИН СССР (72) С.1 .Трояновский, В.А.Крутовских, В.И.Гельштейн, Т.А.Чипышева и Г.А.Банников (53) 578.085.23(088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS,,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К КЕРАТИНУ У 17 ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изучения механизмов цитодифференцировки в норме и паталогии. Целью изобретения является получение штамма

151) 4 С 1 2 iV 5 / 0 0 А 6 1,(3 9 / 3 9 5 гибридных культивируемых клеток животних Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к кератину 9 17 человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/Ñ, иммунизированных фракцией промежуточных филаментов, с клет- . ками миеломы Х 63-Ag 8.653. Штамм культивируют на среде Игла в модификации Дульбекко с 207. эмбриональной телячьей сыворотки. Секреция МКА на

5-й день культивирования составляет

5-10 мкг/мл. МКА относятся к классу

ISG2b(H). B реакции иммуноблоттинга с кератинами из культуры клеток

HeLa и срезов органов человека IKA реагируют одной полосой с кератином м.м, 46 КД(У 17) .!

433979

Изобретение относится к биотехнологии и может быть, использовано для изучения механизмов цитодифференцировки в норме и патологии °

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирую,щего моноклональные антитела (MKA) к кератину N - 17 человека. 10

Штамм получают следующим образом.

Фракцию промежуточных филаментов выделяют из толстой кишки крыс путем последовательной экстракции буфером низкой ионной силы (140 шМ NaC1) и 15 буфером высокой ионной силы (1,5 М

КС1) в присутствии 1 -ного тритона

Х100. Мышей ВА?,В/c иммуниэируют об щей дозой антигена 0,5 мг на мышь.

Первая инъекция: внутрибрюшинно смесь,20 равных (по 0,2 мл) объемов антигена и адъюванта Фрейнда. Последующие пять внутрибрюшинных инъекций проводят с интервалом в 10 дней с неполным адъювантом. Последнюю внутривенную инъекцию проводят за 4 суток до гибрив дизации. Далее 10 клеток селезенки иммунных мышей гибридизуют r. 4х10 клеток миеломы Х 63 — Ag 8.653 с помощью 457.-ного раствора полиэтиленгликоля с м.м. 1000. Культивирование гибридных клеток проводят в 96-луночных платах на питательном слое перитонеальных макрофагов мышей (10 гиб4 ридных клеток на 10 макрофагов, высеянных накануне). Питательная среда:

ДМЕМ с 107. эмбриональной телячьей сыворотки, 107 лошадиной сыворотки, пируват (1мМ), 10 М гипоксантина, 4 ° 10 М аминоптерина и 1,6.10 М 4р тимидина. Гибридомы клонируют 4 раза, высевая по .1 клетке. на лунку, содержащую 10 макрофагов. Отбор клонов

4 осуществляют по иммунофлуоресцентному окрашиванию культуры клеток крыси- 45 ной гепатомы 27. Супернатант одного из 800 положительных клонов реагирует в реакции иммуноблоттинга с кератином У 17 человека.

Полученный штамм гибридных клеток обозначают Е3. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных

Института цитологии АК СССР под номеРом 1350 и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда культивирования — среда Игла в модификации Дульбекко (ДИЕМ) с

20!! эмбриональной теляч ней снноротки (или 101 эмбриональной телячьей сыворотки и 107 лошадиной сыворотки), 1 мМ глубамина, 100 ед. гентамицина в 1 мл.

Для выращивания штамма используют стеклянную или пластиковую посуду.

Во флакон объемом 25 см в 5 мл сре6 ды засевают 2-5 х 10 клеток. Пассаж — 1 раэ в 4-5 дней той же дозой клеток. Без подсчета клеток — 1:3. о

Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5%. СО<. Культивирование гибри— дом возможно в мышах линии BALB/с.

Продуктивность штамма.

Секреция МКА на пятый день культи,вирования составляет 5-10 мкг/мл.

Стабильная секреция продукта сохраняется до 30 пассажей в культуре.

Кариологические признаки.

Модальное число хромосом — 51.

Характеристика полезного продукта.

МКА относятся к классу IgG 2Ь(Н).

В реакции иммуноблоттинга с кератинами из культуры клеток HeLa и срезов органов человека MKA реагируют одной полосой с кератином м.м. 46KD (Ф 17).

Контаминация. ьактерии и грибы в культуре при длительном наблюдении и посевах на питательные среды не обнаружены.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в эмбриональной телячьей сыворотке, содержащей 107. диметилсульфоксида в концентрации

6 t-Зх10 клеток в 1 мл, разливают в стеt рильные пластиковые ампулы при 4 С и замораживают в жидком азоте по программе со снижением температуры на о

1 С в минуту с последующим переносом в жидкий азот, Размораживание: 1 мин при 37 С.Клетки разводят в 5-10 мл полной среды, центрифугируют при комнатной температуре 5 мин при 1000 об/

/мин, сливают среду, заливают 10 мл свежей среды и переносят в лунки 24луночной пластины с макрофагами. Жизнеспособность клеток по включению трипанового синего составляет 50-90 .

Пример. Использование штам" ма Е3.

Кусочек ткани молочной железы, удаленной при биопсии не позже 1 ч после операции, заливают в 77-ный раствор желатины на забуференном физиологическом растворе (ЗФР) и замораживают в жидком: азоте. Срезы толщиной

Составитель И.Серова

Редактор M.Ïåòðîâà Техред М.Ходанич Корректор Л,Патай

Заказ 5517/28 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

14

5 мкм. "яготoRJIяюt яа криотоме и фиксируют 4 мин в 4 -ном растворе формалина на ЗФР. После отмывания в трех сменах ЗФР ставят реакцию непрямой иммунофлуоресценции при комнатной температуре. Первая инкубация — культуральная надосадочная жидкость гибридных клеток ЕЗ (30 мин), вторая инкубация — кроличья антисыворотка против гамма-глобулинов мьппи, меченная флуоресценизоцианатом в разведении

1:20 (30 мин). Инкубации перемежаются отмыванием в ЗФР. Перед заключением в глицерин (1 1 на ЗФР) — окраска . гематоксилином 10 с ° Контроль — пер- вая инкубация ЗФР.

Препарат исследуют в микроскопе с флуоресцентной насадкой. В результате обнаруживают свечение базально расположенных миоэпителиальных клеток междолькового протока молочной железы человека, что свидетельствует о содержании в этих клетках кератина

9 17. Клетки, выстилающие просвет протока, не окрашены и, следовательно, не содержат кератин У 17.

Дальнейшие исследования показывают, что в иммуноморфологических ре33979 акциях непрямой иммунофлуоресценции

MKA избирательно реагируют с белками промежуточных филаментов (кератинов) культивируемых клеток человека линии

HeI,а, но не реагируют с клетками НТ29.

На криостатных резах из органов человека MKA избирательно реагируют с кератином базальных слоев клеток пере10 ходного эпителия мочевого пузыря, многорядного эпителия гортани, бронхов, трахеи, с клетками миоэпителия в железах: слюнных, потовых, молочных; железах подслизистой трахеи, бронхов, пищевода с камбиальными клетками придатков эпидермиса— сальных желез и волосяных фолликулов.

В реакции иммуноблоттинга с препаратами цитоскелета культивируемых клеток НеЬа и слюнной железы человека

:антитела ЕЗ реагируют одной полосой с кератином м.м. 46 Kg(N 17).

Формула изобрете ния

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П)

У 135D, используемый для получения . моноклональных антител к кератину

Ф 17 человека.