Способ культивирования микроорганизмов-продуцентов l-лизина

 

Изобретение относится к микробиологической промыпшецности и касается способа культивирования микроорганизмов с использованием эмульсий пеногасителей, включающих полигфопиленгликолевьв1 эфир, стабилизатор и воду, и может быть использовано при биосинтезе лизина. Целью изобретения является удешевление процесса. Способ заключается в том, что в качестве стабилизатора используют омыленные животные и микробные жиры в количестве 0,2-1% от массы эмульсии. Получаемую стабильную эмульсию полипропиленгликолевого эфира, например пропинола Б-400, вводят в питательную среду в количестве, содержащем 0,015-0,15% пеногасителя от объема среды, а зао тем в периоды усиленного пе нообразования стер ильиую эмульсию подают порци- /Л ями, содержащим 0,0002-0,02% пенога- Y сителя от объема среды. 3 табл. VMM

COI03 СОВЕТСКИХ

С01,!ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„.Я0„„1438235 (51)5 С !2 N 1/20 C 12 Р 13/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ йййВ ЫИ ЧМ

ФЩэй4РР== 4"

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

RO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИИ И ОТКРЫТ! (46) 15. 10. 92. Бюл, Р 38 (21) 3957517/13 (22) 26.09.85 .(72) В.Н.Чернин, Б.E.Чистяков, В.С.Молочков, E.И.Вальгер, Я.B.Ëèå- па, А.К.Докин, В.Г.Беденко и P,Ä.Ñîéфер (53) 663. 15(08&.8) (56) Виестур У.З. и др. Способы и устройства для пеногашения в микробиологических процессах. M.: ОНТИТЗИмикробиопром, 1973.

Носова A.Â. и др. Исследование стабилизаторов леногасительных эмульсий. "Химико-фармацевтический журнал", 1984, 4, с. 474-477. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ - ПРОДУЦЕНТОВ L-ЛИЗИНА (57) Йзобретение относится к микробиологической промышлецности и касае ется способа культивирования микроорганизмов с использованием эмульсий пеногасителей, включающих полипропиленгликолевый эфир, стабилизатор и воду, и может быть использовано при биосинтезе лизина. Целью изобретения является удешевление процесса. Способ заключается в том, что в качестве стабилизатора используют омыленные животные и микробные жиры в количест" ве 0,2-1% от массы эмульсии, Получаемую стабильную эмульсию полипропиленгликолевого эфира, например пропинола Б-400, вводят в питательную среду в количестве, содержащем 0,015-0,15% пеногасителя от объема среды, а за- . д сО тем в периоды усиленного пенаобразова- ния стерильную эмульсию подают порциями, содержащими 0,0002-0,02% пенога" сителя от объема среды. 3 табл. С., 14 18 1 1 б

П",оббрб .т; ииб. б тибиllf(г (Is!I(робио-. !! о Гич((. I(nl; ИРОббб.!швбси ббпр. б; Г и I(л(л(f à Гб

Гп((.Оба культи вирОбб<бббия миб(р(бnpгv><из м(бв Г иб пользованием (.интетическббх пеиогасителей и может быть использоваíо при биосинтече L-ëèsHlla.

11белью изобретения является удешевление процесса °

Способ осуществляют следующим об- 10 разом.

Иикроорганизлпа выращивают при аэрации на питательной среде, в которую добавлена стерильная эмульсия поли пропиленглчколевого эфира, например., 15 пропинола Б-400, стабилизированная омыленным жиром в количестве 0,21,0 мас.7..

Омыление жинотного или микробного жира проводят 407. — ным водным раство- 20 ром гидроокиси калия или натрия при

80-95 С н течение 1-1,5 ч н зависимости от нида жирового сырья при пе ремешивании реакционной массы.

Стерильную эмульсию вносят в таком количестве, чтобы содержание полипропиленгликолевого эфира и питательной среде составило 0,015-0,15X„

В процессе культиниронания стериль- . ную эмульсию добавляют в периоды уси-30 ления вспеиивания порциями, содержащилы 0,0002-0,077 полипропиленгликолево"о эфира от объема среды.

Пример 1. Осуществляют биосингез лизина с помощью культуры микроор-З5 ганизма Brevibacteriur!I sp.22L в ферментере емкостью 100 м . Выращивание

3 микроорганизма ведут н 50 м стерильз ной питательной среды, содержащей

10 т (20 к объему) свеклосахарной 40 мелассы; 1 м (27) кукурузного экстр ракта; 5, 3 и (10, 6X) ферменталиэата

ВВ1<," 0,9 т (1,8X) хлористого аммония, 55 кг (0,117) двузамещенного фосфата аммония и 30 кг (0,015 пропинола Б-400 к объему среды) 25Х-ной эмульсии пропинола Б-400, стабилизированной омыленным рыбьим жиром в концентрации 0,5 мас.Х.

Эмульсию готовят следующим образомо

В реактор с мешалкой загружают

3 т воды и 20 кг омыленного рыбьего жира. После полного растворения стабилизатора в реактор добавляют 1 т полипропиленглнколевого эфира-пропилена Б-400, смесь перемешивают и про пускают через диспергируощее устрой= ство. Получают 4020 кг 25Х-пой эмульб". Ии пб и! l I ëI и1 е и» Г тамб б(ии з ИГ(ббяи ббб)й

0,5 мв, . Х, бблблбббеииогбб рьббьего жир».

Опрсденя.(бт устойчивость эмульсии к коалесиеиции путем цеитрифугировлиия ее в цб.итрифуге при 4000 об./мии в течение 15 мии. Вепичину устойчивости в процентах рассчитывают по формуле

V — V

X — — ---- ., 1007. о б о где Ч вЂ” объем полипропиленгликоле 3.. ного эфира в эмульсии, см

V — объем пыделившейся фазы, см

Для данной эмульсии X - =997. После стерилизации паром при 130 С в течение 2 ч эмульсию используют для добавления в ферментер. Величина устойчивости эмульсии после стерилизации

Х 957.

Омыление рыбьего жира проводят следующим образом.

В реактор, снабженный тихоходной мешалкой и греющей рубашкой, загружают рыбий жир с числом омыпения

178,2 мг KOH/г в количеб тве 25 л и добавляют рассчитанные по числу омыленин 5,1 л 407-ного водного раствора едкого натра. Щело пбой гидрализ ведут при 80-85 С н течение 1.5 ч при периодическом перемешивании. Процесс прекращают при достижении реакционной массой рН 8.

В качестне посевного материала используют 24-часовую культуру продуцента в количестве 5 м, выращенную на питательнрй среде с 4Õ мелассы, 77. кукурузного экстракта, 17. хлористого аммония.

Ферментацию проводят в асептических условиях при 30-32 С, непрерывной аэрации и перемешинании сжатым воздухом в количестве 1 м /мин на 1 м культуральной жидкости, при рН среды в пределах 7,3-7,5, давлении í аппарате 0,2-0,3 ати. Регулирование пенообразования осуществляют путем добавления в ферментер из колб стеричьной эмульсии пеногасителя порциями по 0,4 л (0,00027. пропинола Б-400 от объема среда) н периоды резкого усиления вспенивания. Процесс биосинтеза ведут 59 ч. Получают 50 м культураль3 ной жидкости с содержанием лизина

32,5 г/л. Выход биомассы 36 г/л.

Суммарный расход стабилизированной эмульсии пропипола Б-400 иа операцию

j <18 го< r;»«<л 298 л, что в пересчете пя собстпеппо пропипол 8-400 составляет

74,5 к;.

П р и и е р 2. Осуществляют биоб синтез лизина с помощью культуры микроорганизма М1.сгососслз glutamicum э

Р 95 в ферментере емкостью 100 м при условиях, аналогичных описанным в примере 1. 10

В питательную среду до стерилизации вводят 300 кг (О, 157 пропинола

Б-400 от объема среды) 257-ной эмульсии пропинола Б-400, приготовленной следующим образом. 15

В реактор с мешалкой загружают

3 т воды и 40 кг омыленного микробного жира. После полного растворения стабилизатора в реактор добавляют 1 т пропинола Б-400, смесь перемешивают 20 и пропускают через диспергатор. Получают 4040 кг 257.-ной эмульсии пропинола Б-400, стабилизированной 1 мас.7. омыленного микробного жира. Устойчивость данной эмульсии составляет 25

X=100 . После стерилизации паром, как в примере 1, устойчивость эмульсии равна X=1007 и ее используют для добавления в ферментер и внесения в питательную среду. 36

Омыление микробного жира проводят следующим образом, В реактор, снабженный, тихоходной мешалкой и греющей рубашкой, загружают микробный жир с числом омыления

179,2 кг КОН/r в количестве 20 л и добавляют рассчитанные по числу омыления 4,5 л 407.-ного водного раствора едкого кали. Щелочной гидро- 4р лиз ведут при 80-850С в течение 1,5 ч при периодическом перемешивании.

Процесс прекращают при достижении реакционной массой рН 8.

Ферментацию ведут как указано в примере 1, регулируя пенообразование добавлением в ферментер по трубопроводу стерильной эмульсии пропинола

Б-400, стабилизированной омыленным микробным жиром, порциями, содержащим

0,02Х полипропиленгликолевого эфира от объема среды. Продолжительность ферментации 64 ч. Получают 49 м кульЭ туральной жидкости с содержанием лиэи 5,. на 34,2 г/л. Выход биомассы 40 г/л.

Сумиарный расход стабилизированной эмульсии пропилена Б-400 на операцию составил 250 л, что в пересчете на

15 с <. «T «<» «т

6?,5 кг.

Г! р и и е 1 ..1 . .<1еу<ке<-. г«<пч: г биосинтез лпэнпя <. пл;.«<и ю «удь гуры мпкр< г 1 раппа<<1 Р1Pv1b 1<..<.<. Г1 <<<1< зп, Г-531 в ферме тере «и«ость«100 и в течение 72 ч, кяк о<п1е..и<о и прпмере 1.

В питательную среду до стерилпэялпп вводят 100 л (0,081 проппноля Б- <ОО от объема среды) 4ОХ-пой «<улт син пропипола Б-400, стабилизир«<япнс и оиыленныи рыбьии жиром в количестве

1 мас.7. Оиыление рыбьего жира .и приготовление эмульсии проводят по примеру l. Устойчивость исходной эмульсии Х=100%, после стерилизации устойчивость эмульсии Х=99%.

Пеногашение на режиме осуществляют путем подачи в фериентер данной стерильной эмульсии порциями, содержащими 0,008Х пропинола 8-400 or объема среды. Получают 52 и культуральной з жидкости с содержанием лизина 35 4 г/л.

Выход биомассы 36 г/л. Суммарный< расход стабилизированной эмульсии на операцию составил 166 л, что в пересчете на пропинол Б-400 составило

70,5 кг.

П р и и е р 4. Осуществляют биосинтез с помощью культуры микроорганизма Brevibacterium sp. Е-531 в ферментере емкостью 100 иЗ в течение 69 ч, как описано в примере 1. В питательную среду вводят 300 кг (0,15Х пропинола

Б-400 от. объема среды) 25Х-ной эмульсии пропинола b-400, приготовленной следующим образом.

В реактор, снабженный мешалкой, загружают 3 т воды и 10 кг сорбиталя С-20 и перемешивают систему до полного растворения стабилизатора. В другой,реактор, снабженный мешалкой н греющей рубашкой, загружают 1 т пропинола Б-400.и 10 т сорбитана С, представляющего твердое вещество. Пос ле нагревания и перемешивания до полного растворения сорбитана С про" пинол Б-400 передаэливается в первый реактор, смесь перемешивается и пропускается через диспергатор, Получают 4020 кг 25Х-ной эмульсии пропинола Б-400, стабилизированной 0,5 иас.Х смеси сорбитана С-20/сорбитана С.Устойчивость эмульсий Х=97Х, после стерилизации Х=95Х.

Пеногашение на режиме осуществляется путем подачи данной стерильной эмульсии в ферментер порциями,соле1 ж)!Ш!!ь 1! О, (!. 7, т)р!)!fit!!опп 1 -4 00 от г . Г)>t tfff с рг! ы. Пс)31,"1п!и! )!);! кул).ту1);I f1 h!! oIt жил к <)сTlf с !)1!е т):я и нне>1 лизи на 31, ") г/л. Выхо11 б)1<>ма1 сы 38 г/л.

Сум) !ар))ь!й рпсхс.11 эмульсии н» опера111!!!) с!)станляет 340 л, что н пересчете H:.I ffpoffftttoп Ь-1!00 Оста))пнет 85 кг.

Полученные резул. таты приведены в таб)л. 1. 10

Как видно из таблицы, при использовании н качестве стабилизатора эмульсии полипропиленгликолевого эфи. pR )1апример 1ц)опинола Б-400, омылеи,fttrx >v3poII. имеет место повышение по 15 сравнению с иэнестным способом устойчи1 ости эмульсии при одинаковой концентрации стабилизатора, П р и и е р ..ы 5-10. Осуществляют биосинтез лизина с помощью культуры 20 микроорганизма Brevibacterium зр.

E-531, либо другой культуры и ферментере на питательной среде, как onuca-.

ftо в примере 1. В качестве пеногасителя используют 253-ные эмульсии пропи- 25 иола Б-400 или полипропиленгликоленого эфира спиртов фракции С -С, со сре)!ней мол, м. 1000, стабилизированI3fIe омыленным рыбьим или микробным

KHpoH H JUTE с1)аннения MbllloM xosHHcT 30 венным.

Эмульси)п готовят следующим образом.

В реактор с мешалкой загру)"„ают 3 т воды и 20 кг стабилизатора эмульсии и фиксируют время его полного раство- 3 рения. После полного растворения стабилизатора в реактор добавляют 1 т пеftoFBc)t Те.ttÿ, смесь перемешивают и пропускают через диспергирующее устройство. После перемешивания отбирают 40 пробу эмульсии для определения среднего диаметра капель, а затем по ходу диспергирования проводят отбор проб для дисперсионного анализа.

Устойчивость эмульсии до и после 45 стерилизации определяют, как н примере 1.

Результать1 определения параметров эмульсий с различными стабилизаторами (содержание пеноггзсителя н эмульсии 50

25 об.X) приведены в табл.2.

Ферментацию проводят в асептичесо ких условиях при 20-32 С, непрерывной аэрации и llepeffem)tf3afff313 сжатым воздухом в количестве 1 м /мин на 1 м 55 культуральной жидкости, при рН среды н пределах 7,3-7,5 иданлении в аппа рате 0,2-0,3 ати. Регулир!)нзи11е пенообраэоняния осу!цест))л)1етсл, как н прии! р1. ? Ilv PH лобан)!еflltfl f3 !)е1)ме IITc p

lto тру!1о)1рь)воду стерильной эмульсии пе1!огасителя. По of.< нчании ферментапии определяют содержание лизина н кул1.-тчрял).но!3 жидкости и выход биомассы, а такте расход пеногасителя на не ног!3)1!ение . Данные по культивирова11ию продуцентов лизина с использованг)пtf эмульсии по табл.2 приведеHhl в табл.3.

Анализ табл.2 и 3 показынает сут щественное преимущество омыленных жиров по сравнению с мылом как стабили3aTopoI3 эмульсий полипропиленгликоленых эфиров. При испбльзовании омыленных жиров сокращается время приготовления эмульсии, получаются эмульсии с меньшим, чем в случае с хозяйственным мь)лом, размером ка11ель, а следовательно и с большей их численной концентрацией. Это приводит к нозраста" нню пеногасящей эффективности и, как следствие, к снижению расхода пеногасителя. Последнее, как видно из дан,ных табл.3, благоприятно влияет на рост культуры и биосинтез лизина. Кроме того, н .)мыленных жирах имеет место сочетание свойств компонентов, позволяющее получить устойчивые. эмульсии полипропиленгликоленых эфирож.

Ф о р му л а и з î б р е т е н и я

Способ культивиронания микроорганизмов — продуцентов 1.-лизина, предусматривающий приготовление питательной среды и эмульсии пеногасителя из полипропиленгликолевого эфира со стабилизатором, добавление ее в питательную среду, засев и последующее проведение процесса ферментации с контролем уровня пенообразонания и дробной подачей эмульсии пеногасителя, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью удешевления процесса, в качестве стабилизатора используют животные или микробные жиры, которые предварительно омыляют при 80...85 С н течение 60...90 мин до устаионления рН 8, при этом эмульсию готовят из расчета содержания н ней омь)ленных жиров 0,2 а . ° 1 мяс ° Æ и в IIIIç ате льну10 среду вводят из расчета 0,015О, 1 5 мас, Ж полипро пиле н глик олен ого эфира от объема среды, а дробную пода 1у ведут из расчета 0,00020,02 мас.7 °

I (I

I l

g I

Щ г» о х

L»

ci o

cd а

А» х

an л »! еО

Ф

» л о

D о

I 1 х 11:"4 х а и Icl cI жаca v °

»

1 и w о о (еЪ

IXI й б I

С4 йе о из

С»С

Ф1 н л! е ) СЧ

° a РЪ и

23 е е

ЬО е ( Л

1 Л X

ce u ! л х е» :Ф

tJ ф

Q O и

ФГ1 о

I х а

Са 6J

И X

1 х м л л х

f и ф о

f» и

1 ъ

1

Х g 4

О 4 о о хе

I Э Е юхх

1 1 I

Э CII

1» Фъ 1

° е4

М

Ф

un и an

td ,а 4

° r4 С»С

Се!

CI1 ° н а

CCI

l 4382 5

М 4> ,Ol и и с ъ ща .о 1

° р Щ

CII °

1 а д ®

М

СМ

, ;) е4 (Ч

3ч л

Ф и е» ие

ccI an

4> II

° л gg .е н а

CC! aCa 3 о в о ееФ ди

3ж

1 х а

55 о о о о е о

ФЧ а о

1 е»

0 и

Щ е» о

D

СЧ

In о о о

СеЪ

D о

in

ФЧ о о о о о в

CV Ф Ъ о о о ап

Феа в н ь о

° е ф, ь м а%9 э ь д. йй а I»

5у2х ььй о а о аа ь ь х

6 3 ф O м . х х х

Э Ol ь

vo o (х

5v5 о а и

3 а м

С» 3c E Вй сч и р.

@сo @ ь ха

Ф Ф;х ю о в

iФ ь

5е

Р ь

Ю

ej ь

It (6 а

0j

3«38235!

Таблица 3

Содержание

Расход пеногаснПример

5 Brevibacterium

sp. 22Ь

74,5

32,5

6 Brevibacterium вр. Е-531

37

33,5

7 Мдсгососсов glut.

В 95

- 62,5

34,2

8 Brevibacterium

sp. Е-531

35

32,5

9 Brevibacterium

sp. 22L

36

30,5

62

78

31,0

10 То же

4 Brevibacteripm вр. Е-531

69 85

31,5 ч

Составитель З.фалуннна

Текред JI.Ñåðäâêîàà Корректор С.Шекмар

Редактор С.Рекова

Тираж 390 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР . по делам иэобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб., д. 4/5

Закаэ 4569

Проиэводственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Культура микроорганизма

Продолжительность ферментации, ч лизина в КЖ, г/дм ь

Выход биомассы, г/дм теля на пеногашение, кг