Способ получения мутантов чумного микроба,дефектных по синтезу оболоченного антигена "фракции 1

 

Изобретение относится к области бактериальной генетики, а именно к области мутагенеза плазмцц (П). До настоящего времени не существует простого и надежного способа получения Fra Г тох штаммов- (Ш) чумного микроба , необходимых для конструирования , высокоактивных Ш-продуцентов мышиного токсрна. Целью изобретения является упрощение и повышение эффективности способа получения мутантов чумного микроба, у которых стабильно отсутствует способность к продукции фракции 1 при сохранении Тох -признака . Цель достигается за счет отбора клонов с делецией генов, определяющих продукцию Fra 1 на рУТ-плазмиде Ш y.pestis 377, после посева клеток этого Ш, содержащего П рУР: : Tii, на оксалатный агар при 37 С. Способ применяется в генетических исследованиях с У. pestis для исследования роли Fra 1 в биологии этого микроорганизма и упрощают получение моноспецифических диагностических сывороток к мьшиному токсину чумного микроба. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

122 А1 (19) SU(II) 1 (5ц 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А STOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4123258/28-13 (22) 26.09.86 (46) 23.11.88. Бюл. Я 43 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) М.И. Заренков и Н.А. Гончарова (53) 576.851.45(088.8) (56) Генетика,. биохимия и иммунология особо опасных инфекций. Ростов-наДону, .1967, вып. l, с. 1972. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТОВ ЧУМНОГО МИКРОБА, ДЕФЕКТНЫХ ПО СИНТЕЗУОБОЛОЧЕЧНОГО АНТИГЕНА "ФРАКЦИИ 1" (57) Изобретение относится к области бактериальной генетики, а именно к области мутагенеза плазмид (П). До настоящего времени не существует простого и надежного способа получения

Fra 1 Тох+ штаммов.(Ш) чумного микроба, необходимых для конструирования.высокоактивных Ш-продуцентов "мышиного"токсина. Целью изобретения является упрощение и повьппение эффективности способа получения Ътутантов чумного микроба, у которых стабильно отсутствует способность к продукции

"фракции 1" при сохранении Тох -приз+ кака. Цель достигается за счет отбора клонов с делецией генов, определяющих продукцию Fra 1 на рУТ-плазмнде

Ш У.pestis 377, после посева клеток этого Ш, содержащего П рУР: : Тп, на о оксалатный агар при 37 С. Способ применяется в генетических исследованиях с У. pestis для исследования роли

Fra 1 в биологии этого микроорганизма и упрощают получение моноспецифических диагностических сывороток к.

"мьпниному" токсину чумного микроба.

I 439) 22

Изобретение относится к бактериаль. ной генетике, а именно к области мутагенеза плазмид.

Целью изобретения является упроще5 ние и повышение эффективности способа.

Упрощение и повышение эффективности способа достигается за счет высева клеток У.pest, is 377 рУТ, pYV, рУР :: Tn) на пластинку питательного 10 ,агара, бедного по содержанию свободными двухвалентными катионами, с последующим исследованием выросших при

37 С клоков.

Способ осуществляется следующим 15 образом.

Готовят 1 млрд взвесь 18-часовой культуры У.pestis 377 рУТ, рУ7, рУР :: Tn) в физрастворе и 10 кле9 ток высевают на пластинку I,SZ-ного 20 агара В (или Хоттингера) с 15-25 мМ оксалата Иа, рН 7,0-7,2. Посевы инкубируют 2-3 сут при 37 С.

В этих условиях на поверхности агара вырастают 200-400 крупных коло- 25 ний (3 мм в диаметре) на фоне газона мелких (1 мм) клонов. Клет1ки из крупных колоний после 2-кратной чистки на агаре с оксалатом Na

) о при 37 С проверяют на способность к, продукции "фракции 1" в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с коммерческим антительным диагностику1 мом и выделяют из них плазмиднуюДНК. Достаточно исследовать 6-8 клонов, поскольку 90-957. крупных колоний не продуцируют "фракцию 1" в результате делеции ДНК рУТ-плазмиды размером

l5-20 Мй. Продукцию токсина проверяют в реакции преципитации с анти- 0 токсической сывороткой. Она, как правило, сохраняется. Полученные делеционные варианты плазмид могут быть переданы в клетки авирулентных вакционных штаммов для конструирования

"безопасных" штаммов-продуцентов с помощью известных способов при мобилизации конъюгативными Р-плазмидами.

Пример 1. 10 клеток У.pes9

tis 377 (рУТ, рУР::Tnl ) высевают на поверхность агара LB, содержащего

15 М оксалата. Na рН 7,0 и инкубируют посевы гри 37 С. Через 2 сут о вырастают 200-400 колоний размером 3 мм. Бактерии из шести проверенных н и 55 колоний не продуцируют фракцию 1 по и 11 данным РНГА, продукция мышиного токсина по данным преципитации в теле с антитоксической сывороткой у них сохраняется. Выделения и гель-электрофорез у плазмидной ДНК обнаруживают делецию плаэмид рУТ. Реверсии к Fra

1 -фенотипу не наблюдают в течение о года при хранении штаммов при +4 С.

Пример 2 ° 10 клеток У.pes5

tis 377 (рУТ, рУР::Tn10) высевают на пластинку 1,5Х-ного arapa 1 В с

20 мМ оксалата Fa, рН 7,2. Посевы инкубируют при 37 С 3 сут. Частота появления крупных колоний -10 . 10 таких клонов исследуют на продукцию

"фракции 1", "мышиного" токсина и проводят гель-электрофорез выделенной из них плазмидной ДНК. В восьми из них имеется делеция рУТ-плаэмиды с потерей "фракции )", но с сохраненной продукцией "мышиного токсина.

Пример 3. 10 клеток штам5 ма У.pestis 377 (рУТ:: Тп, рУ7, рУР:: Tn 1 О) высевают на агар, содержащий 25 мм оксалата Na, рН 7,1, при о

37 С. Через 2 сут отбирают для анализа 1 0 крупных колоний (частота их

-ь появления -10 ), В девяти из них отсутствует Fra 1 и имеет место делеция рУТ::Tn7 при сохранении Тох признака.

Оптимальной концентрацией оксалата

Na, добавляемого в питательный агар, является 20 MN. Однако использование

l5-25 мМ оксалата Na также дает хоро-. шие результаты. Концентрация выше

25 мМ ингибирует рост клеток, а при дозе ниже 15 мМ вЂ” Fra 1 -клоны мало отличаются по размером от Fra 1 -вариантов, что затрудняет отбор мутантов. рН 7,0 — 7,2 используемой среды является обычной для выращивания клеток чумного микроба. Время инкубации . посевов 2-3 сут. Ранее 2 сут колонии слишком мелкие, более 2 сут инкубировать не рекомендуется, так как Рга 1 -клоны увеличиваются в размерах, приближаясь по величине к Гга

1 -вариантам, что может затруднить отбор мутантов.

Предлагаемый способ позволяет получить Тох Fra -варианты штамма У.

pest;is 377, отсутствие оболочечного антигена у которых обусловлено потерей генов, детерминирующих его продукцию в результате делеции плазмиды рУТ. Причина, обуславливающая такие делеции при росте используемого штамма íà оксалатном агаре, пока не выявлена. Возможно это результат формула изобретения

Составитель Н. Кузенкова

Техред N.Дидык

Редактор Н. Гунько

Корректор.М. Шароши

Заказ 6041/25

Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

14391 индукции IS-рекомбинации в условиях дефицита Са и Mg . Полученный делеционный вариант плазмиды рУТ из У.

pestis 377 легко передать путем транс5 дукции или мобилизации конъюгативной

R-плазмидой в другие штаммы чумного микроба. При этом в силу несовместимости гомологичных репликонов происходит утрата резидентной рУТ-плазмиды и полученные штаммы приобретают стойкий Tox+Fra -фенотип.

Предлагаемый способ является простым, поскольку для получения искомых мутантов достаточно однократного 1б посева клеток У.pestis 377 на агар с оксалатом Na, в то время как известный способ требует многократных пересевов на средах с дефицитной сывороткой к "фракции 1". Значительно повышается эффективность способа.

Если в известных способАх удается получать единичные мутанты, не продуцирующие оболочечный антиген, которые к тому же часто реверсируют к 25

22

4 дикому фенотипу, предлагаемый спосбб обеспечивает выход сотен клонов со стабильным Fra 1 -фенотипом: вследствие делеции соответствующих генов.

Кроме того, способ не требует использования дорогих реактивов и занимает мало времени.

Способ получения мутантов чумного. микроба, дефектных по синтезу оболочечного антигена "фракции 1" путем посева взвеси на питательную среду, о инкубирования при 37 С и исследования выросших клонов, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения и повышения выхода мутантов, взвесь клеток штамма Yersinia pestis

377, содержащего наряду с плазмидами рУТ, рУЧ плазмиду рУР::Тп, детерми нирующую пестиционогенность, высевают на оксалатный агар, содержащий

15-25 мМ оксалата натрия, и инкубируют 2-3 сут.