Способ выделения бактериальной днк

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в ген но-инженерных работах и бактериологических исследованиях. Целью изобретения является упрощение способа вьщеления ДНК из бактериальных клеток, улучшение качества целевого продукта И повышение безопасности работы с патогенными микроорганизмами. Основное отличие предложенного способа состоит в том, что весь процесс выделения ДНК проводят в один этап в закрытой центрифужной пробирке. После одномоментной загрузки всех компонентов не требуется никаких манипуляций с лизатом вплоть до сбора целевого продукта . Этим достигается сокращение числа операций в ходе процедуры вьщеления, а также уменьшение времени контакта, исследователя с исходным материалом . Принципиально важным методическим приемом, обеспечивающим возможность одноэтапного вьщеления ДНК, является способ внесения бактериальных клеток в центрифужную пробирку. Материал помещают между двумя слоями лизирующей смеси, нижний из которых наслоен непосредственно на поверхность раствора хлористого цезия. Предложенный метод лизиса клеток позволяет отказаться от перемешивания лизата и предотвратить повреждающие гидродинамические воздействия на освобождающиеся молекулы ДНК, а также обеспечивает полное освобождение ДНК из связи с РНК и белком. Вследствие этого целевой продукт содержит меньше повреждений и в меньшей степени, чем в случае использования известного способа, загрязнен примесями. Благодаря тому, что полнота лизиса в данном случае может регулироваться путем изменения времени контакта клеток с лизирующей смесью, изобретение может быть использовано не только для получения плазмидной ДНК, но и для вьщелейия хромосомного материала. 2 3 . п. лы. S (Л 4; со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИ4ЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) ()1) (S1) 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО-ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4222305/28-13 (22) 03.04,87 (46} 23.11.88. Бюл. Ф 43 (71) Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (72) А.В.Дроздов, О.Т.Можаров и П.И.Анисимов (53) 577.113.083(088.8) (56) Mikesell P., Ivins ВеЕ., Ristroph I.D ° et а1, Infect. Immun., 1983,.v. 139, N - 1, 371-376,. (54) СПОСОБ ВЬ1ДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ

ДНК (57) Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в ген но-инженерных работах и бактериологических исследованиях. Целью изобретения является упрощение способа вьщеления ДНК из бактериальных клеток, улучшение качества целевого продукта и повышение безопасности работы с патогенными микроорганизмами. Основное отличие предложенного способа состоит в том, что весь процесс выделения ДНК проводят в один этап в закрьг той центрифужной пробирке. После одномоментной загрузки всех компонентов не требуется никаких манипуляций с лизатом вплоть до сбора целевого продукта. Этим достигается сокращение числа операций в ходе процедуры выделения, а также уменьшение времени контакта исследователя с исходным материалом. Принципиально важным методическим приемом, обеспечивающим возможность одноэтапного выделения ДНК, является способ внесения бактериальных клеток в центрифужную пробирку.

Материал помещают между двумя слоями лизирующей смеси, нижний из которых наслоен непосредственно на поверхность раствора хлористого цезия.

Предложенный метод лизиса клеток позволяет отказаться от перемешивания лизата и предотвратить повреждающие гидродинамические воздействия на ос- ф вобождающиеся молекулы ДНК, а также обеспечивает подвое освобождение ДНК В/и из связи с PHK и белком. Вследствие этого целевой продукт содержит меньше повреждений и в меньшей степени, чем в случае использования известного способа, загрязнен примесями. Благодаря тому, что полнота лиэиса в данном случае может регулироваться путем изменения времени контакта клеток с лизирующей смесью, изобретение Ц может быть использовано не только Фаад для получения плазмидной ДНК, но и для выделения хромосомного материала. )ф

2 з.п. A-лы.

1439124

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в генноинженерных работах и бак-ериологичес5 ких исследованиях.

Целью изобретения является упрощение способа вьщеления ДНК из бактериальных клеток, улучшение качества целевого продукта и повышение безопасности работы с патогенными микроорганизмами, По предлагаемому способу весь процесс выделения ДНК проводят в один этап в закрытой центрифужной пробир- 15 ке. После одномоментной загрузки всех компонентов не требуется никаких последующих манипуляций с лизатом вплоть до сбора целевого продукта. Этим достигается сокращение числа операций в ходе процедуры выделения целевого продукта, а также уменьшение времени контакта исследователя с исходным материалом, что приобретает особое значение при использовании для выде- 25 ления ДНК патогенных штаммов.

Бактериальные клетки вносят в центрифужную пробирку между двумя слоями лизирующей смеси, нижний из которых наслоен непосредственно на 30 поверхность раствора хлористого цезия. Этим достигается мягкий и глубокий лизис, при котором ДНК полностью ! освобождается иэ клетки и легко отделяется от прочих продуктов деструкции клетки при последующем ультрацентрифугировании..

Такое внесение материала позволяет отказаться от перемешивания лиза- 40 та и предотвратить повреждающие гидродинамические воздействия на освободившуюся ДНК. В результате применения указанного методического приема получаемый продукт содержит меньше по-15 вреждений и в меньшей степени, чем в случае использования известного способа, загряsíåí примесями ДНК и белка °

Предлагаемый способ позволяет регулировать полноту лизиса путем изменения времени инкубации клеток с лизирующей смесью, а следовательно, в отличие от известного может быть использован не только для получения плаэмид, но и для выделения хромосомной ДНК, Дополнительное обогащение продукта нужным типом ДНК (хромосомной или плазмидной) осуществляется за счет изменения температурного режима при центрифугировании, Пример l. Вьщеление плазмиды

plK 4К иэ Escherichia cali НВ 101.

Культуру бактериальных клеток вьг ращивают на двух флаконах с 75 мл скошенного arapa Хоттингера, рН 7,2, о в течение суток при 37 С, Клетки смывают с агара 3 мл физиологического раствора.

В 36-миллилитровую полиалломерную центрифужную пробирку вносят 25 мл раствора: хлористый цезий 25 г, бромистый этидий 2 мл (из основного раствора 5 мг/мл), TES-буфер 15 мл (состав TES-буфера: трис(гидроксиметиламинометан ) 5 мМ, динатрневая соль этилендиаминт етраук сусной кислоты

ЭДТА 0,5 мМ, NaCl 5 мМ, рН 8,0) . На поверхность раствора хлористого цезия наслаивают 3 мл лиэирующей смеси: бридж-58 1%, дезоксихолат натрия

0,51, додецилсульфат натрия 0,1%, ЭДТА 10 мМ, лизоцим 5 мг/мл, бромистый этидий 0,5 мг/мл, трис 50 Ы1, рН 8,0, Уравновешивают пробирки, затем наслаивают 3 мл взвеси культуры в физиологическом растворе и еще

2 мл лизируюшей смеси. Помещают пробирки в ротор, выдерживают 3 ч при комнатной температуре, затем центрифугируют в ультрацентрифуге при

40000 об,/мин (140000 g) при 10 С в течение 40 ч.

После центрифугирования пробирки облучают ультрафиолетовым светом и визуально определяют наличие плазмидной суперспирализованной ДНК. 3атем прокалывают стенку пробирки иглой от шприца и собирают ДНК, Собранную ДНК освобождают от бромистого этидия и переосаждают этанолом по известной методике, Преципитат растворяют в 500 мкл TES-буфера и

1 мкл этого раствора подвергают анализу методом электрофореза в 0,71-ном агарозном геле.

Пример 2. Выделение плаэмид большой молекулярной массы.

Используют штаммы Тегз пia pestis, несущие плазмиды pFtra/Tox (65 MD), рСай (47 МД), P,.Pu (38 МД), Культуру выращивают аналогично о примеру 1, но при 28 С 2 сут. Выделение ДНК проводят в тех же условиях, что и в примере 1, В отличие от мультикопийной плазмлды рИК 4К крупные плазмиды предстаСоставитель О. Скуратовская

Редактор Н. Гунько Техред М.Дидык

Корректор С.1Цекмар

Заказ 6041/25 Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 1439 12 влены в клетке лишь единичным репликоном, поэтому выход ДНК из одинакового количества биомассы соответственно меньше, 5

Пример 3. Выделение хромосомальной ДНК из Vibrio cholerae eltor

RV 79.

Выделение ведут аналогично примеру 1, но время лизиса составляет t0

1,5 ч, а центрифугирование проводят при 20 С.

Таким образом, использование изббретения дает возможность получать высокоочищенную плазмидную и хромосом- 15 ную ДНК более простым и безопасным, по сравнению с известными, способом.

Формула из об р ет ения

1, Способ выделения бактериальной

ДНК, включающий лизис клеток смесью етергентов и лиэоцима и ультрацент4

Д рифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, улучшения качества целевого продукта и повышения безопасности работ с патогенными микроорганизмами, бактериальные клетки помещают между двумя слоями лизирук щей смеси, наслоенной на поверхность раствора хлористого цезия, и процесс выделения ДНК проводят в один этап в закрытой центрифужной пробирке.

2. Способ по л. 1, о тл ич аю шийся тем, что для выделения плазмидной ДНК лизис проводят в течение 3-4 ч.

3. Способ по и. 1, о т л и ч аю шийся тем, что для выделения хромосомной ДНК лизис проводят в течение 1-1,5 ч, а центрифугирование— при температуре 18-22 С.