Штамм бактерий bacillus suвfilis - продуцент эндонуклеазы рестрикции bsu 15 i

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Штамм депонирован в ВКПМ ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под номером Б-3667. Штамм продуцирует эндонуклеазу рестрикции Bsu 15 1, которая является изошизомером реетриктазыС1а 1. Bsu 15 1 расщепляет последовательность нуклеотидов 5 -ATCGAT-3 в составе двуцепочечноЙ ДНК. Биомассу штамма выращивают при аэрации в питательном бульоне на основе гидролизата йильки до достижения ранней стационарной;.фазы роста. Клетки разрушают ультразвуком и выделяют рестриктазу хроматографией на биогеле А г.О,5 м, целлюлозе ДЕ-52 и фрсфоцеллюло Р-11. Выход фермента 300000..ед./1 г сырой биомассы. 1 табл. с S W СП 00 :о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН..Я0„„144958

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМЪ/ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

3»

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4189498/28-13 (22) 02.02.87 (46) 07.0 1.89, Бюл. Р 1 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии и Научно-производственное .объединение "Фермент" (72) В.Е.Репин„ С.X.Äåãòÿðåâ, Н.А.Петров, Е.А.Приходько, К.А.Бендукидзе, H.È.Ôoäoð и Д.П.Вайткявичус . (53) 577.15(088.8) (56) Jentsch S. Restriction and Nodification in В.subtilis: Sequence Specification of Restriction / Nodification System Bsu И, Bsu Е; and Bsu F.

7 ° Bacteriol, 1983, vs 156, р. 800808 °

Takchiro S. et al. Site specific

deoxyribonucleases in Bacillus subtilis and other Bacillus strains.J.Bacterio1 1976, ч. 128, р. 473476.

Sugisaki И. et аl. New restriction endonucleases. from Acetobacter

aceti and Bacillus aneurinolytieus.Nucleic Acids Res, 1982, ч.10,, р. 5747-5752.

Цветкова Н.В., Иилейковская N,N, и др. Очистка и определение субстратной специфичности рестрикционной эндонуклеазы Веш1. — Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.

1987, 4, 1.9-22. щ) 4. С 12 N 9/16 //(C 12 g 1/20, С 12 R 1:125) (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВАС11ЖБ SUBTI

LIS — ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИК

ЦИИ ВЯП 15 1 (57) Изобретение относится к микро- биологической промьппленности. Штамм депонирован в BKIIN ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под номером В-3667. Штамм продуцирует. эндонуклеазу рестрикции Bsu 15 1, которая является изошизомером рестриктазы Cla 1. Bsu 15 1 расщепляет последовательность нуклеотидов

5 -ATCGAT-3 в составе двуцепочечной

ДНК. Биомассу штамма выращивают при аэрации в питательном оульоне на ос нове гидролизата вильки до достижения ранней стационарной, фазы роста. *

Клетки разрушают ультразвуком и выделяют рестриктазу хроматографией на бион еле А -;.0,5 м, целлюлозе ДЕ-52 и фосфоцеллюло е P-11. Выход фермента 300000.,ед./1 г сырой биомассы.

1 табл.

83 2

7,4, После инкубации при 30 С образуют крупные, белесые колонии, выпуклой формы, слизистой консистенции.

Продолжительная инкубация (2-4 суток) приводит к исчезновению слиаи, колонии крупные, плоские с небольшой морщинистостью. Среда используется для оживления культуры.

Среда 2. Состав как у среды 1 только без...агара. Среду используют для препаративного выращивания клеток, о

При 30 С и аэрации 2 объема в минуту, 200 об/мин мешалки. Мутность культуры ровная.

Полученная рестриктаза Bsu 15 1 характеризуется следующими свойствами; узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК 5 -ATCGAT-3, оптимальное значение рН 6,5-7,5, оптимальная тем о пература 30-37 С. Рестриктазная активность не меняется в широком диапазоне концентраций NaCl до 100 мИ.

Сравнение характеристик предлагаемого штамма и известного представлено в таблице, в которой показано получение рестриктаз из Bacillus subtilis

В-3667 и Bacillus species.

14495

ВК1 И В-3667 имеет следующие харак "ери тики.

Иорфологические признаки. В молодо культуре (16-18 г) клетки палочко идные„ размером 0,7-0,8 мкм в поперечнике и 2-3, иногда 5 мкм, в длину Располагаются одиночно, парами ил образуют цепочки. Подвижные, жгути1си латеральные. Образуют эндоспоры эллипгической формы, расположенные преимущественно центрально, не более одной на клетку-спорангий, Отчетливой раздутости спорангия не наблкф ает6я. Не образуют околосноральнь1х тел, грамположительные.

Физиолого-биохимические признаки.

Аз робы, каталазоположительные. При ра сщеплении глюкозы образуют кислоту, но не газ. Реакция Фогес-Проскауэра положительная. Не .образуют индол, вс сстанавливают нитраты до нитритов.

Гйдролиэуют крахмал и казеин, разжижают желатину.

Культуральные признаки. Хорошо растут на обычных питательных средах ((АРПА, ИПБ). Оптимальная температура о о р< ста 37 С, но растут и при 50 С.

Среда 1: агар 15 г/л, гидролизат кйльки 40 г/л, ИаС1 20 г/л, рН 7,2Гидролиэат кильки 40 v/ë, НаС1

20 г/л

Бульон Хоттингера или среда, приго-. товленная на основе кровезаменителя

Параметры

Осаждение в стрептомицинсульфате и далее: сульфатаммонийное осаждение, хроматография на оранжевой сефарозе, фосфоцеллюлозе P-11, гепаринсефарозе

Хроматография на биогеле

А-015 м1 целлюлозе

ДЕ-52, фосфоцеллюлозе

Р-11

Этапы очистки

12000

Выход, ед/г

300000

1 зобретение относится к микробиолог и и представляет собой штамм, коD тор и можно использовать для получения эндонуклеаэы рестрикции .(рестрик5 тазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 -ATCGAT"

3 в составе двухцепочечной ДНК. цель изобретения — получение штамма,, продуцирующего рестриктазу задан- 10 ной специфичности с высоким выходом, быс ро растущего на обычных питательных средах. тамм продуцирует рестриктазу, наз анную,Bsu 15 1, обладающую способ остью узнавать и расщеплять послед вательность нуклеотидов

5 CGAT-3 . Глубинное культивирова.о ние проводят при 30 С и аэрации

4- объема в минуту на питательной ср е, содержащей, г/л воды: гидроли ат кильки 40, NaC1 20>,до достиже я фары замедления роста. ВМход ре триктазы 300000 единиц на грамм биомассы, 25 Используемый штамм В. зыЬ 1 з (15)

ВК1 И В-3667 получен в результате целе аправленного поиска штаммов — продуцентов рестриктаз, Штамм ..ВасП1аз subtilis (15", Пример 1. Получение рестриктазы Bsu 15 1.

Штамм В. subtilis (15) поддерживают в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом. Для оживления штамм пересевают на чашки Петри с агаризованной средой; содержащей, г/л: гидроливат кильки 40, NaCl 20 (среда 1), агар 15, и инкубируют при

37 С в течение суток. Выросшие клетФормула изобретения

Штамм бактерий Eacillus subtilis

ВКПМ В-3667 — продуцент эндонуклеазы рестрикции Bsu 15 1.

Составитель Н.Ходарев

Техред Л.Сердюкова Корректор Э.Лончакова

Редактор И.Горная

Заказ 6934/28 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и .открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, iK-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 14495 ки переносят в жидкую среду 1. Инокулят выращивают в термостатированной качалке при 37 С, 200 об/мин в течение ночи. Полученный инокулят вновят

5 в ферментер и выращивание проводят при тех же условиях с аэрацией 2-"объема в минуту в питательной среде 1 до достижения ранней стационарнай фа" зы роста. Культуральную жидкость ох- 1р лаждают и клетки осаждают центрифугированием.

30 г сырой биомассы В. subtilis (15) суспендируют.в 80 мл 50 мМ трис-

НС1, рН 7,5. Клетки разрушают ультра- 15. звуком ("МБЕ" США). Клеточный дебрис удаляют центрифугированием. Супернатант наносят на колонку с биогелем

А — 0,5 м, предварительно уравновешенную буфером А (11аС1 0,8 N; Тритон

Х-100=0, 1, КН РО4 20 мМ, рН 7,5, ЭДТА 0,5 мМ, 2-меркаптоэтанол 0,.1 мм, Фракции элюируют тем же буфером и тестируют на наличие рестриктазыой активности по способности специфи- 2б чески расщеплять ДНК фага 1 при ин» кубировании н буфере: трис-НС1 20мМ, рН 7,5, МяС1 10 мМ, NaC1 50 мМ, 2-меркаптоэтанол 10 мМ при 37 С.

Фракции, содержащие рестриктазную ак- gp тивность, объединяют и диализуют против буфера В .(КН Р04 20 мМ, рН 7,5 °

ЭДТА 0,5 мМ, 2-меркаптоэтанол О, 1мМ).

Выпавший осадок удаляют центрифугированием, а супернатант,наносят на колонку с целлюлозой ДЕ-52, уравнове35 шенную буфером В. Велки элюируют

0-1.М градиентом NaCl, фракции объемом 10 мл анализируют на рестриктаз83

4 ную активность. Отобранные фракции объединяют и диализуют против буфера В. Градиентную хроматографию проводят аналогично предыдущей. Пробы обладающие рестриктазной активностью, о объединяют и хранят при -20 С в буфере В с 50 .-ным глицерином.

Получено 10 мл препарата Bsu 15 1 с активностью более 500 ед/мкл, т.е.

300000 единиц на грамм сырой биомассы.

Рестриктаза стабильно хранится в течение месяца.

П ри м е р.2. Определение активности рестриктазы Bsu 15.1.

Фермент инкубируют 60 мин при

37 С в 40 мкл смеси: ДНК фага h

1 мкг, трис-НС1 0,1 М, рН 7,0; МаС1

0,05 М; МяС1, 0,01 М. Затем проводят электрофорез в 0,7 .-ном агарозйом геле. За единицу активности берут количество фермента для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага

Я в течение 1 ч.

Таким образом, в соответствий с предлагаемым изобрегением получен и охарактеризован высокоэффективный штамм — продуцент рестриктазы, обеспечивающий повышенную продукцию фермента, превышающую в 25 раз продукцию известного штамма.