Способ получения бактериальных суспензий

 

Изобретение относится к микробиологии , биохимии и может быть использовано для получения стабилизировадных мембран клеток микроорганизмов. Целью изобретения является стабилизация мембран как изолированных, так и находящихся в составе неразрушенных клеток бактерий различных таксономических групп (что приводит к стабилизации клеток бактерий), В суспензию клеток бактерий и мембран микроорганизмов вносят стабилизирующий агент в концентрации (0,2-7,0) Ю Моль. В качестве стабилизирующего агента используют алкилрезорцины с насыщенными алкильными радикалами длиной от 4 до 10 атомов углерода, находящимися во 2-,4- или 5-м положении в бензольном кольце. Стабилизированные суспензии клеток бактерий и мембран микроорганизмов различных таксономических групп.хранятся в течение 0,5-2,0 лет при температуре 1-25°С. 4 табл. (Л

СО 03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК!

5П 4 С 12 N 1/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

flPH fMHT CCCP (21} 4189207/28-13 (22) 30.01.87 (46) 07,03,89. Бюл,¹ 9 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии и Институт микробиологии АН СССР (72} A.С.Капрельянц, Д.Н.Островский, Г.И.Зль-Регистан, N.Н.Грязнова, В.И.Дуда, А.Н.Козлова, Г,Б,Бравова, Ю.З,Лилле, Г.А,Осипов, E.À.Øàáàíoýà, В.В.Помазанов и А.Д.Сорокина (53) 576.8.093(088.8) (56) Биохимия, 1981, т.46, ¹- 8, с.!499-1509. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ

СУСПЕНЗИЙ (57) Изобретение относится к микробиологии, биохимии и может быть исполь-: зовано для получения стабилизированных мембран клеток микроорганизмов, Изобретение относится к микробио-. логии, биохимии и может быть использовано для получения стабилизирован т ных мембран клеток микроорганизмов, Целью изобретения является стабилизация мембран как изолированных, так и находящихся в составе неразрушенных клеток бактерий различных таксономических rpynn

Пример 1. Суспензию мембран

Micrococcus lysodeikticus в количестве 1 мг белка/мл вносят в полярографнческую ячейку объемом 1 мл. Добавляют НАДН и малат в качестве субстратов дыхания. Регистрируют скорость поглощения кислорода (контроль).

„„Я0„„3463754 А1

Целью изобретения является стабилизация мембран как изолированных, так и находящихся в составе неразрушенных клеток бактерий различных таксономических групп (что приводит к стабилизации клеток бактерий). В суспензию клеток бактерий и мембран микроорганизмов вносят стабилизирующий агент в концентрации (0,2-7,0)«

«10 Моль. В качестве стабилизирующего агента используют алкилрезорцины с насыщенными алкильными радикалами длиной от 4 до 10 атомов углерода, находящимися во 2-,4- или 5-м положении в бензольном кольце. Стабилизированные суспензии клеток бакте- ф рий и мембран микроорганизмов различных таксономических групп хранятся в течение 0,5-2,0 лет при температуре 1-25 С.. 4 табл.

Затем в ячейку дополнительно вносят алкилрезорцин до концентрации

5 «10 моль, через 1 мин после внесения регистрируют дыхание суспензии.

После чего добавляют алкилрезорцин до концентрации 1 «10 моль, регистрируют дыхание суспензии. Операции

1 повторяют при внесении алкилрезорци-ь нов до концентрации 10 моль с шагом концентрации в два раза больше предыдущей.

Полученные данные приведены в табл.l, где указаны концентрации стабилизирующих агентов, вызывающие ингибирование дыхания на 507, Концентрации алкилрезорцина от 5«

1463754

l, 20

° !О . моль до 0,2 10-" моль не вызывают подавление дыхания на 50Х.

Пример 2. Культуру В.cereus выращивают на жидкой синтетической среде следующего состава, г/л:

NHqH РО 1,0; КС1 0,2; YgS04>7H O

0,2; СаС1 0,002; глюкоза 4; мясопептонный бульон 107. (об/об) при аэрации 1 л воздуха (1 л среды) до стадии перехода вегетативных клеток в стационарную фазу роста. Суспензик клеток В. cereus с ОП = 2,0 вносят в полярографическую ячейку объемом

1 мл. Опыт проводят согласно примеру

Проведенные исследования показывают, что при внесении моно- и диалкилреэорцинов с насыщенным алкильным радикалом длиной от 4 до IO атомов углерода, находящимися во 2-, 4- или

5-м положении в бензольном кольце в концентрации 0,2-7,0 ° 10 4 моль, в суспензию изолированных мембран, так и клеток бактерий происходит ингибирование ферментов ЭТЦ, что свидетель— ствует об их стабилизации (табл.l).

Пример 3. В суспензию мембран М,lysodeikticus вводят гидрофобный зонд пирена до конечной концентрации 15 мкМ. Во флуориметрическую кювету помещают суспенэию мембран в количестве 0,2 мг белка/мл. Регистрируют спектр флуоресцентности пирена при возбуждении (335 нм}. Из соотношения интенсивности флуоресцентности эксимеров (470 нм) и мономеров (393 нм) оценивают параметры эксимеризации (контроль). В суспенэию мембран с введенным зондом пирена вносят 5-С,„ алкилрезорцин в количестве 0,2-1,0 10 4 моль. Проводят измерения аналогично контрольному варианту.

Данные приведены в табл.2.

Из полученных результатов следует, что параметр эксимериэации пирена снижается по мере увеличения концентрации алкилрезорцина. Алкилрезорцин

I существенно снижает латеральную диффузию липидов в мембране, что свидетельствует о стабилизации липидов в мембране.

Пример 4 Культуру В.cereus выращивают на жидкой синтетической среде, состав которой приведен в примере 2, В одну часть суспензии В.cereus вводят алкилреэорцин 4-С, с конечной концентрацией 0,5 ° 10 моль, а др у4 гую до конечной концентрации 4-С

2,5»10 " моль, Стабилизирующий агент вносят в суспензию вегетативных клеток в фазу замедленного роста (ОП =

2,0), через 1 ч после внесения стабилизирующего агента клетки микроскопируют, При рефрактометрическом определении степени рефрактильности клеток после внесения 4-С с конечной концентрацией 0,5 10 М и 2,5кl0- М установлено, что клетки приобретают степень рефрактильности (и) аналогичную бактериальным эндоспарам (и эндос пор 1 471 и 6frBT. кл п »««1,42) . Полярографическое определение дыхания клеточной суспенэии показывает. отсутствие поглощения кислорода, т.е. полное ингибирование ферментов ЭТЦ. На протяжении

2 лет при хранении полученных суспенэий при температуре от 1 до 25 С активность ЗТЦ не выявляется. Клетки при микроскопировании B фазовом контрасте не теряют высокой степени светопреломления и сохраняют свою целостность, Оптическая плотность клеточных суспензий за время хранения не меняется, что свидетельствует об отсутствии деградационных процессов.

В табл.3 приведены условия стабилизации суспензии мембран M. 1ysodeikticus при внесении стабилизирующих агентов — алкилреэорцинов (4-С

5-С 40), Пример 5. В суспензию мембран М. lysodeikticus с количеством

2,0 мг белка/мл вносят 4-С до конеч— ной концентрации О, 5 «10 4 М. Су спензию стабилизированных мембран хранят в течение 6 мес при 1 С. С периодич1 ностью в 1 мес проверяют оксидазную активность ферментов ЗТЦ при использовании в качестве субстрата малат, а также определяют оптическую плотность суспенэии.

На протяжении всего периода хранения активность ЗТЦ не выявляется.

ОП суспензии не снижается. Зто свидетельствует о стабилизации и сохранности мембранных препаратов, В табл, 4 даны условия стабилизации суспензий мембран В.cereus при внесении стабилизирующих агентов— алкилрезорцинов (4-С6, 5-С „) .

Пример 6 ° Условия проведения опытов приведены в табл. 3. О стабильности суспензий мембран судят по пара1463754

Таблица 1 руюшая дыхание мембран с контролем, и 10 моль

Алки нных мембран M.lysodeikэкзогенных субстратах

0,6 (HA11H5, 0,6 (малат)

2,7 (НАДН), 5,0 (малат)

3,0 (НАДН) 2-С

4-С

4-С

5-С"

l 1

3,5

7,0

Не ингибир ует.

5-С

5-С, 1,2 (HAnH)

0,6 (НАДН), 0,8

О, 25 (НАДН)

0 7 (НАДН), 2 0

I I (НАДН) (мал ат) (малат) 5-С 1о

2-С 9-5-С, 2-С -5-С

3 1

2-С -5-"С

l 1

2, 5 (HAPH), 3, 0

3,0 (НАДН), 3,0

1,5 (НАДН>

2,5 (НАДН)

1,0 (НАДН), 0,8

2-С4 — 5-С, 4

2-С -5-С

2-С -5-С

2-С 9-5-С,О

Грамицидин S (малат) (малат) (малат) +

Алкилрезорцины, имеющие алкильные радикалы с длиной менее 4-х атомов углерода, не эффективны в указанном диапазоне концентраций стабилизирующего агента. метрам, описанным в примере 5, определения проводят с той жз периодичностью, данные соответствуют вышеприведенным ре зульт ат ам.

Пример 7. Опыты проводят аналогично примеру 5, но с суспензией мембран В. cereus. Условия проведения опытов приведены в табл,4. Параметры, свидетельствующие о стабильности сус- 10 пензии мембран В.cereus определяют в соответствии с примером 5, с той же периодичностью.

Результаты опытов идентичны данным 15 опыта примера 5.

Таким образом, предлагаемый способ получения стабилизированных суспензий биологических мембран позволяет стабилизировать как изолированные мембраны, так и находящиеся в составе неразрушенных клеток бактерий, что

В последнем случае приводит к стабилизации клеток бактерий, стабилизи-: ровать мембраны вне зависимости от

Не измеряли

0,5

1,5

2,0

Не измеряли

1,5

2,0

1,4

0,8 таксономического положения бактерий, из которых выделены мембраны,и хранить стабилизированные суспензии биологических мембран и клеток бактерий длительное время (0,5-2,0 года) в широком интервале температур от 1 до 25 С.

Фор мул а изобретения

Способ получения бактериальных суспензий путем введения стабилизирующего агента, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью стабилизации мембран как изолированных, так и находящихся в составе неразрушенных клеток бактерий различных таксономических групп, в .качестве .стабилизирующего агента используют моно- и диалкилрезорцины с насыщенными алкильными радикалами длиной 4-10 атомов углерода, находящимися в 2-,4- или

5 — м положениях в бензольном кольце, в концентрации (0,2-7,0) ° 10 моль.

1463754

Таблица 2

Концентрация

5-C), ° 10 M О 0,2 0,3 0,8 1,0

Эксимериэация

0,25 0,16 0,09 0,07 0,065

Таблица 3

Таблица 4

15! П р н м е ч а н н е. В указанных условиях сусненэни сохраняют стабильность в течение 6 мес. (, П р H м е ч а н и е. В укаэанных условиях сусвенэин сохраняют стабильность в течение 6 мес.

Составитель А.Федоров

Техред Л.Олийнык Корректор И.Пуска.

Редактор Г, Волкова

Заказ 790/31 Тираж 500 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,101

1 (0,2 4-С4 1,0

0,2 4-С

2,0 4-С 1 в0

2,0 4-Сс 2,5

2,0 5Cie 2е5

l5

l.

20 0,2 .0,2

2,0

2,0

0,2

2,0

2,0

4-С, 4-С

4 С

4-Сь

5-С„

t0

5- : о

Со

0,5

2,$

0,5

2,5

0,5

2,5

0,5

2,5

1

l5