Гексапептид, обладающий гепатопротективным действием

 

Гексапептид формулы Phe-Ala-Gly-Phe-Gly-Arg , обладающий гепатопротективным действием . С (О

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Phe-Ala-Gly-Phe-Gly-Arg гексапептиду:

Phe-Ala-Gly-Phe-Gly-Arg, ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬПИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3772913/23-04 (22) 16 ° 07.84 (46) 07.04,89, Бюл. N - 13 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР (72) E.È.×àçoí, В.Н.Смирнов, В.А.Виноградов, В.М.Полонский, В.А.Тищенко, М.И.Титов, Ж.Д.Беспалова и Б.Л.Пекелис (53) 547.964 ° 407 (088.8) (56) Патент США 4366148, кл. С 07 С 103/52, опублик. 1982.

Scott J. Physiological, pharmacological and pathological actions

of glucocorticoids on the digestive

system. — Clin. gastroentегоl.

Изобретение относится к новому биологически активному соединению— обладающему гепатопротективным действием, которое может найти применение в медицине, Цель изобретения — поиск в области биологически активных соединений пептидной природы, обладающих высокой гепатопротективной активностью и не имеющих побочных свойств.

Синтез предлагаемого гексапептида проводят следующим образом.

Карбобензокси-глицил-аргинин (I).

К суспензии 1,58 г (9,07 ммоль) аргинина в 25 мл диметилформамида добавляют 3,30 г (9,98 MM) и-нитрофе,.SU„;, 1470739 А1 (5g 4 С 07 К 7/06, А 61 К 37/02 (54) ГЕКСАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ГЕПАТОПРОТЕКТИВНЬМ ДЕЙСТВИЕМ (57) Гексапептид формулы обладающий гепатопротективным действием, 2 нилового эфира карбобензокси-глицина.

Смесь размешивают при комнатной температуре в течение суток. Диметилформамид отгоняют, остаток растворяют в 5 мл метанола и добавляют 300 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровы,вают, промывают на фильтре эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе.

Выход продукта 3,09 г (93%), т.пл. 135 †1,5 С. (оа) = +10,3 (с 1, ДМФА).

R = 0,25 (н-бутанол:уксусная кис1 лота:вода 3:1:1) — А..

R = 0,54 (хлороформ:метанол:32% уксусная кислота 60:45:20) — Б.

К = 0,33 (этилацетат:пирщшн:уксусная кислота: вода 45: 20: 6: 11) — В.

Карбобензокси-фенилаланил-глициларгинин (II). Через раствор 3,09 г (8,46 ммоль) продукта (I) в 35 мл

1470739

40 трифторуксусной кислоты в течение

1 ч.пропускают ток сухого бромистого водорода. Растворитель упаривают, к остатку добавляют 150 мл эфира, выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в воде и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит IRA-410 (ОН -форма) до отрицательной реакции на ионы брома. Смолу отфильтровывают, промывают на фильтре метанолом, водой, фильтрат упаривают, остатки воды удаляют азеотропной перегонкой с изопропиловым спиртом, Остаток растворяют в 25 мл диметилформамида, к раствору добавляют 3,91 r (9,31 ммоль) п-нитрофенилового эфира карбобензокси-фенилаланина. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение суток. Диметилформамид отгоняют, остаток растворяют в 5 мл метанола и продукт осаждают добавлением 300 мл эфира.

Выпавший осадок отфильтровывают, про"мывают на фильтре эфиром, сушат в 25 вакуум-эксикаторе, Выход 3,75 r (86X) продукта, т.пл, 133-134 С. (oL) = 17,2 (с 1, ДМФА).

R< = 0,30 (А),R = 0,66 (Б), 30

R — О 43 (В).

Кар бобенз окси-глицил-фенилаланилглицил-аргинин (ХТХ) . Продукт получают аналогично продукту (II), исходя из 2,71 r (5,28 ммоль) (II и

1,93 r (5,83 ммоль) п-нитрофенилового эфира карбобензоксиглицина.

Выход продукта 2,46 r (82X), т.пл. 142-144 С. (oL)ä = — 17,3 (с 1, ДМФА) .

R = 0,57 (Б), R = 0,35 (В)

= 0,45 (н-бутанол:муравьиная кис1 лота:вода 15:3:1), Карбобензокси-аланил-глицил-фенилаланил-глицил-аргинин ((IV) Продукт получают аналогично продукту (II). Исходя из 2,46 r (4,32 ммоль) продукта (III) и 1,64 r (4,75 ммоль) п-нитрофенилового эфира карбобензоксиаланина получают 2,13 г (777) 50 продукта (IV), т,пл. 148-149 С. (оС) = -20,8 (с 1, ДМФА).

R = 0,64 (Б), R = 0,38 (В), 1Р = 0 39 (н-бутанол:пиридин:аммиак

9 конц.:вода 20:12:3:15) — Г.

Карбобензокси-фенилаланил-аланилглицил-фенилаланил-глицил-аргинин (V). Продукт получают аналогично продукту (II) . Исходя из .0,64 г (0,99 ммоль) продукта (IV) и 0,46 г (1,1 ммоль) п-нитрофенилового эфира карбобензокси-фенилаланина, получают

0,63 г (81X) продукта V, т.пл.

150-153 С. (о ), = 3,5 (c 1, МеОН).

О 42 (А), R = 0,70 (Б)

R = 0,39 (В).

Ф е нил алан ил-ал ан ил- гли цил-фе н илаланил-глицил-аргинин (VI), 0,63 г (О, 80 ммоль) продукта (V) растворяют в 10 мл метанола и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре, метанолом, упаривают,остаток переосаждают из 5 мл . метанола эфиром (100 мл), сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный продукт вносят в колонку (600x15) с Сефадексом SPC-25 и фракционируют в градиенте пиридин-ацетатнаго буфера

0,05 М вЂ” 1,00 М.

Выход продукта 0,34 г (652), т.пл., 154-156 С. (К) = +8,4 (с n,s, Н О).

Н = 0,58 (Б), Н = 0,32 (Г), R = 0,44 (н-бутанол:лиридин:уксусная кислота:вода 10,5:6:1:7,5).

Данные аминокислотного анализа: фенилаланин 2,13 (2), аланин 1,00 (1), глицин 1,97 (2), аргинин

0,93 (1) .

Индивидуальность синтезированного гексапептида подтверждена спектром ЯМР и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Пептид элюируют одним пиком при 39,37. градиента на 12,8 минуте. (Колонка

250 4,6 мм, Spherisor BODS, 5p, подвижная фаза Л, 0,05М КН РО, рН 3,0;

В:СИ СИ; grad.20 507. В за 20 мин9 давление 1500 psi, скорость 1мм/мнн, детекция при 214 мм).

Проведены биологические испытания предлагаемого гексапептида.

Изучение гепатопротективного действия гексапептида в сравнении с преднизолоном проведено на 48 мышахсамцах линии balb C.

Развитие острого гепатита вызывают у мьппей, подвергнутых 12 ч голоданию, с помощью D-галактозамина гидрохлорида, которьй вводят в/б, разведенного в 0,1 мл физиологического раствора концентрации 700 мг/кг.

Контрольная группа животных получала в/б 0,1 мл физиологического раствора. Животным, получавшим D-галактоз1470739 амин, сразу же после его выделения инъецируют предлагаемый гексапептид (100 мкг/кг), преднизолон (5 мг/кг) или физиологический раствор (0,1 мл) п/к. Повторные инъекции исследуемых веществ производят через б ч. Каждая из групп состояла из 12 животных.

Забой мьппей производят методом декапитации, собирают кровь из шейных сосудов и в ее сыворотке определяют концентрации аланиновой трансаминазы (АЛТ) и глютаматдегидрогеназы (ГДГ).

Статистическую обработку полученных результатов проводят с помощью 15

t-критерия Стьюдента. За достоверные. принимали различия на уровне значимости 957 (при РА 0,05). Полученные результаты представлены в табл.1.

I 20

Как следует из табл.1, D-галактозамин вызывал достоверное повышение концентраций исследуемых ферментов (АЛТ в 1,5, а ГДГ более чем в

3 раза). Предлагаемый гексапептид практически полностью блокировал повьппение концентрации АЛТ и в 2 раза по- .нижал концентрацию ГДГ, При введении преднизолона отмечена лишь недостоверная тенденция к снижению концент- 30 раций ферментов.

Предлагаемый гексапептид изучен в экспериментальной модели острого поражения печени у крыс самцов линии

Вистар (78 особей), вызываемого с помощью четыреххлористого углерода.

Крысам после 12 ч голодания вводят

СС1 концентрации 1 мл/кг, разведенный в оливковом масле, в/б. После введения СС1 крысам инъецируют гек- 40 сапептид в 4 различных дозах (10,30, 100 и 300 мкг/кг). Повторно гексапептид вводят через б, 24 и 30 ч.

Контрольная группа животных вместо гексапептида получает физиологический 45 раствор:(0,2 мл). Все группы животных состоят из 13 крыс. В крови исследованы концентрации АЛТ и ГДГ. !

Полученные результаты представлены в табл. 2. 50

Как следует из табл. 2, СС1+ вызывает достоверное повьппение концентрации ГДГ. Повышение АЛТ не является статистически значимым в силу малого количества наблюдений. Гексапептид 55 снижает оба показателя зависимо от дозы. Особенно выраженно снижается более специфичный печеночный энзим

ГДГ.

Предлагаемый гексапептид, кроме того, зависимо от дозы блокирует летальность крыс при использовании четыреххлористого углерода.

Полученные результаты представлены в табл.3.

Как следует из табл.3 если четыреххлористый углерод вызывает гибель

777 (10 из 13) животных, то при введении предлагаемого гексапептида в дозах 100 и 300 мкг/кг летальность вовсе отсутствует.

Статистическую обработку при поражении печени, вызванном четыреххлористым углеродом, в отношении показателей энзимов проводят с помощью и -критерия Стьюдента, а в отношении летальности — с помощью критерия

Х Пирсона.

Во всех экспериментах с применением предлагаемого гексапептида не отмечалось изменений со стороны клеточного состава крови, основных гемодинамических показателей. При изучении острой токсичности гексапептида Ы3 составляет 120 мг/кг.

Таким образом, в использованных экспериментальных моделях острого поражения печени предлагаемый гексапептнд достоверно снижает в крови концентрации ГДГ и АЛТ, повышение которых характерно для патологического процесса, развивающегося в печени.

Это свидетельствует о наличии у гексапептида гепатопротективных свойств.

Преднизолон, использованный в обычно применяемой в клинике парэнтеральной дозе, не оказывал выраженного влияния на концентрации ферментов. Сопоставление предлагаемого гексапептида с соматостатином показывает, что гексапептид превосходит последний по эффективности — летальность OX по сравнению с 20Х у соматостатина, максимально эффективная доза в 15 раз меньше (100 мкг/кг — для гексапептида, 1,5 мг/кг — для соматостатина).

Наиболее распространенньп., применяемый при лечении заболеваний печени, препарат — преднизолон применяют в дозе, в 50 раз превосходящей дозу предлагаемого гексапептида.

1470739

Таблица

Группа животных

AJIT ед

ГДГ, ед

113,6 1.5,5

Контроль

D-Галактозамин+

+физиологический

32,5+3 8

121,6+16,0

170,8+f 0, 1 раствор

D-Галактозамин+предлагаемый гексапеп62,8 4,9

115,4+5,2 тид

D-Галактозамин+

+преднизолон

Различие между 1 н 2 группами достоверно.

Ф МРазличие между 2 и 3 группами лостоверно.

Таблица 2 (АЛТ, ед

Группа животных

874,3 118,3

2339, 6+333, 4

603,3+118,0

2 110, 1+374,5

«Ф

Различие

Различие с 1 группой достоверно. со 2 группой достоверно.

Таблица Э

Мм

Показатели

100 300 10

° °

Количество крыс выживших к 48 ч 3

Летальность,й 77

Различие с группой 0 достоверно.

Виварный контроль

СС1, СС1, + предлагаемый гексапептид (10 мкг/кг)

СС1 + описываемый гексапептид (30 мкг/кг)

СС1, + описываемый гексапептид (100 мкг/кг)

СС1 + описываемъN гексапептид (300 мкг/кг) 115, 2+14, 3 104, 5 10, 1

64).6+3,3 17,2+0,6

4349, 3+ 2285, 1 5619, 7+ 1201, 7

4141, 5+1094, 8 1962, 0+494, 7

3037,8 580 8 1487,3 301,5

Доза гексапептида, мкг/кг

6 . 9 13 13

54. 30 0 0