Способ определения субпопуляций лимфоцитов

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в иммунологии. Целью изобретения является упрощение и повышение информативности способа определения субпопуляций лимфоцитов с помощью моноклональных антител. Способ осуществляется путем проведения двойного варианта иммуноцитохимического ПАП - окрашивания мазков периферической крови или мазков из лейкоконцентрата венозной крови путем высушивания, замораживания, доведения до комнатной температуры, фиксации в формол-ацетоне, ингибирования активности эндогенной пероксидазы. Популяция лимфоцитов определяется при светооптической микроскопии по коричневому ободку в цитоплазме.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 421 5183/28-1 4 (22) 25.03.87 (46) 07 ° 07ю89 ° Бюл ° 11 25 (71) Институт проблем онкологии им, P.F..Êàâåöêîãî (72) Д.Ф.Глуэман, В.А.Надгорная и И.В.Абраменко (53) 615.475 (088.8) (56) Рукосуев В.С. Варианты иммунопероксидазного метода исследования.

Арх.анат.гистол. н эмбриолог.,1979, т.IXXVI, N- 2,,с. 62-66 ° (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБПОПУЛЯЦКЗ

ЛИМФОЦИТОВ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в иммуИзобретение относится к медицине и может быть использовано в иммунологии.

Цель изобретения — упрощение способа и повьппение его информативности.

Пример 1. Мазки из капли крови, смешанной с гепарином, взятой из пальца больного в объемном соотношении 1:10 (гепарин 5000 ед. в .

1 мл) исследуются для уточнения варианта лимфобластного лейкоза.Masки сушили в течение 6 ч на воздухе при комнатной температуре, завернули в алюминиевую фольгу, заморозили и хранили в холодильной установке при -18 С в течение 19 ч. Затем препараты довели до комнатной температуры в течение 5 мин, сняли фольгу °

30 с фиксировали в формол-ацетоне при рН 6,6, промыли в трех сменах забуференного физиологического раствора.

„„SU„„1492286 A 1 (51)4 G Ol N 33/577

2 нологии. Целью изобретения является упрощение н повышение информативности способа определения субпопуляций лимфоцитов с помощью моноклональных антител. Способ осуществляется путем проведения двойного варианта иммуноцитохимического ПАП-окрашивания мазков периферической крови или мазков из лейкоконцентрата веноэной крови путем высушивания, замораживания,доведения до комнатной температуры,фиксации в формол-ацетоне,ингибирования активности эндогенной пероксидазы. Популяция лимфоцитов определяется при светооптической микроскопии по коричневому ободку в цитоплазме.

Провели двойной вариант окрашивания по схеме: первичные моноклональные антитела 1 час, связующая сыворотка 30 мин, ПАП комплекс (пероксидазамоноклональные антитела к пероксидаэе) 30 мин, связующая сыворотка

15 мин, ПАП комплекс 15 мин. Каждый реагент наносили на стекло в пределах очерченного стеклографом круга в количестве 0,02 мл. В качестве моноклональных антител использовали:

ИКО-11, ИКО-13; Лт-1, с ОЛЛ, ИКО-1, Все этапы инкубации шпи при комнатной температуре во влажной камере.

После каждого из них стекла промывали в эабуренном физиологическом растворе. Затем выявили активность пероксидазы: 5 мг 3,3 -диаминбезодин тетрахпорида растворили в 10 мл ЗФР и добавили 0,02 мл ЗЖ-ного раствора перекиси водорода, мазки инкубировали в течение 3 мин. Ядра клеток до1492286

Реакцию МКАТ к лимфоцитам определяли по коричневому ободку в цитоплаэме.

Составитель А.Чирков

Техред Л.Олийнык

Редактор И.Горная

Корректор В.Гирняк

Заказ 3871/47 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101 красили 2Х-ным раствором метиленового зеленого в течение 3 мин.

Реакцию лимфоцита с MKAT определили по коричневому ободку в цитоплаэ5 ме.

Получены результаиы: 60Х ИКО-1

19 ИКО + 11 ; 6Х ИКО-13Х 39Х с

ОПП ; 39Х ПТ-1 °

На основании полученных данных уточнен диагноз больного: 3-острый лимфобластный лейкоз общего типа.

Пример 2. Для определения субпопуляций лимфоцитов донора приготовили мазки иэ лекоконцентрата, высушили на воздухе 6 ч, заморозили о и хранили в холодильнике при -20 С в течение 4 дней.

Затем препараты довели до комнатной температуры в течение 20 мин,сня- 20 ли фольгу, 30 с фиксировали в формолацетоне при рН 6,9, промыли в трех сменах ЗФР, провели двойной вариант

ПАП окрашивания. В качестве первичных мононуклеарных антител использовали ЛТ-1. Все планы осуществлялись при комнатной температуре во влажной камере, мазки после инкубации на каждом этапе промь|вали в ЗФР. Ядра клеток докрасили 2Х-ным раствором метиленового зеленого, Фор мула изобретения

Способ определения субпопуляций лимфоцитов с помощью моноклональных антител путем приготовления цитологического препарата и проведения иммуноцитохимического окрашивания ПАПметодом, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения его информативности, исследование проводят в мазках периферической крови или в мазках из лейкоконцентрата венозной крови,приготовленных посредством добавления антикоагулянта в объемном соотношении антикоагулянт:кровь = 1:10, высушивания, замораживания при — 18...-20еС, последующего доведения до комнатной температуры в течение 5-20 мин, фиксации в формол-ацетоне при рН 6,6-6,9 в течение 30-45 с, ингибирования активности эндогенной пероксидазы

ЗХ-ным раствором перекиси водорода в течение 3-5 мин, проведения двойного варианта ПАП-окрашивания и определения субпопуляций лимфоцитов по морфологическим признакам.