Устройство для замораживания живых биологических объектов в контейнерах

 

Изобретение относится к аппаратам глубокого программного замораживания различных биологических объектов. Целью изобретения является повышение сохранности замораживаемых биологических объектов. Жидкий азот из системы 2 по трубкам 3, 4 через исполнительный орган 5 подают в камеру (К) 1 замораживания. На выступы 15 держателя (Д) 7 надевают контейнеры 8, наполненные раствором с биообъектами до пробок, полости 20 которых заполнены полутвердым гелем нетоксичного вещества. Вводят Д 7 и К 1. После того, как температура в контейнерах 8 сравняется с температурой в К 1, включается электромагнитный клапан 10

поток хладагента проходит по трубке 3 через Д 7, инициируя кристаллизацию водной фазы в геле, и по трубке 11 выходит в атмосферу. После снижения температуры К 1 до точки замерзания раствора с биообъектами начинается кристаллизация в нем, поскольку раствор уже соприкасается с кристаллами льда, торчащими из геля. В устройстве обеспечиваются постепенное обезвоживание клеток и наименьшая степень их повреждения. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

СВОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„Я0„„1522О (51)4 F 25 D 3/10

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4439382/31-13 (22) 29.04.88 (46) 15.11.89. Бюл. К 42 (7 1) Институт физиологии растений им. К.А,Тимирязева (72) А.С.Попов, H.Â.Äîíåö, Н.А.Иса» ков и P.Ã.Бутенко . (53) 621.565(088 ° 8) (56) Авторское свидетельство СССР.

И 1097875, кл. Г 25 D 3/10, 1983.

Авторское свидетельство СССР

& 1440137, кл . Р 25 D 3/10, 1987. (54) УСТРОЙСТВО ДХИ ЗАМОРАЖИВАНИЯ ЖИВЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ В КОНТЕЙНЕРАХ (5?) Изобретение относится к аппаратам глубокого программного замораживания различных биологических объектов. Целью изобретения является повышение сохранности замораживаемьы биологических объектов. Жидкий азот из системы 2 по трубкам 3, 4 через

2 исполнительный орган 5 подают в камеру (К) 1замораживания,,На выступы

15 держателя (Д) 7 надевают контейнеры 8, наполненные раствором с биообъектами до пробок, полости 20 которых заполнены полутвердым гелем нетоксичного вещества. Вводят Д 7 в

К 1. После того, как температура в контейнерах 8 сравняется с температурой в К 1, включается электромагнитный клапан 10; поток хладагента проходит по трубке 3 через Д 7, инициируя кристаллизацию водной фазы в геле, и по трубке 11 выходит и ат иосферу. После снижения тем ературы К 1 до точки замерзания раствора с биообъектами начинается кристаллизация в нем, поскольку раствор уже соприкасается с кристаллами льда, торчащими из геля. В устрой-. стве обеспечиваются постепенное обезвоживание клеток и наименьшая степень их повреждения. 1 s.ï. ф-лы, 1 ил.

1522005

Изобретение относится к холодильной технике, а более конкретно к аппаратам глубокого программного замораживания различных живых биологических объектов, например выделенных из организма или культивируемых в искусственных условиях клеток, тканей и небольших оргBHQB KHBoTHbIx u растений, для последующего их сохранения при сверхнизких температурах и регенерации после оттаивания исходных клеток и тканей, а в случае меристем, почек и эмбрионов растений и животных для возобновления их роста и развития и получения полноценных организмов.

Целью изобретения является повышение сохранности замораживаемьж биологических объектов, На чертеже схематично изображено устройство для замораживания живых биологических объектов в контейнерах.

Устройство содержит теплоизолированную камеру 1 замораживания, систему 2 подачи криоагента в камеру 1, содержащую трубку З,от которой непосрецственно перед камерой 1 ответвляется трубка 4 и исполнительный орган 5. Последний связан с системой Ь программного управления. Устройство также содержит установленный в камере 1 держатель 7 контейнеров

8, выполненньп", в виде тонкостенной трубки, ответвленную от трубки 3 трубку 9 с размещенным на ней исполнительным органом, например,. электромагнитным клапаном 10> связанным с системой б нрограьмного управления и трубку 11 отвода хладагента. Устройство снабжено системой 12 измерения температуры в камере 1 и контейнерах 8 с датчиками 13 и 14, подключенными к системе 6 программного управления.

Держатель 7 имеет выступы 15, в, которых могут быть вь>полнены пазы

1б. Контейнеры имеют пробки 17 или

18, имеющие поперечную перегородку

19, выполненную под ней полость 20, заполненную нетоксичным, водным гелем.

Пробки имеют фиксирующие элементы для крепления их на выступах 15 держателя 7. У пробок 18, такими фиксирующими элементами являются ручки 21, размещаемые в пазах 1б выступов 15, а у пробок 17 такими элементами являются полые ручки 22, плотно надеваемые на выступы 15 держателя 7. При использовании крупных контейнеров емкостью несколько сот

5 миллилитров необходимы дополнительные крепежные элементы, Вся поверхность держателя 7 (за исключением выступов, занятых контейнерами в данном процессе замораживания), и, поверхности подводящей и отводящей трубок 9 и 11 должны быть теплоизолированы. Держатель соединяется с этими трубками быстрозатягивающимися гайками или секторными байонетными замками (не показаны) .

Устройство работает следующим образом.

Включают программу замораживания и жидкий азот из системы 2 по трубкам 3 и 4 через исполнительный орган

5 поступает в камеру 1 замораживания в количестве, достаточном для снижения температуры внутри камеры 1 с заданной скоростью. Электромагнитный клапан при этом закрыт. Тем временем оператор одевает на выступ 15 держателя 7 охлажденные до низкой положительной температуры контейнеры 8, наполненные раствором с биообъекта30 ми до пробок, полости 20 которых заполнены полутвердым гелем нетоксичного вещества, и, следовательно, раствор и гель контактируют между собой.

После снижения температуры в камере 1 примерно до температуры контейнеров

8 оператор устанавливает держатель 7 вместе с надетыми на его выступы 15 контейнерами 8 и быстро соединяет его гайками (или замками) с трубками 9

40 и 11. Контеинеры могут быть расположены под углом 0-45 к вертикали. В контрольный контейнер 8 вставляется датчик 14 так, чтобы его чувствительный элемент находился в центре (или

AQ несколько выше) зоны раствора и во всяком случае над зоной, занимаемой оседающими клетками или другими биологическими объектами. При дальней шем охлаждении камеры 1 температура

50 в ней стабилизируется около (-1 С).

После того, как температура в контей. нерах сравняется с температурой камеры (при скорости охлаждения

0,5 С/мин для этого требуется

55 1-2 мин) включается электромагнитный клапан 10 и поток сначала очень холодных паров, а потом и жидкого азота устремляется по трубке 9 че15., 005 рез держатель 7, инициируя кристаллизацию водной фазы в гел», находящемся в полостях 20 пробок контейнеров 8 и по трубке 11 выходит в атмосферу. Через 10-15 с клапан 10

5 выключается, поток через держатель

7 прекращается,но стабилизация температуры в камере 1 продолжается еще в течение 5-10 мин, чтобы возникшие во время 10-15-ти секундного импульса резкого охлажцения в водной фазе геля кристаллы льда успели вырасти и достигнуть противоположной поверхности, контактирующей с раствором в контейнере. Затем стабилизация выключается и возобновляется медленное снижение температуры в камере с заданной скоростью. Когда температура внутри контейнеров понизится до точки замерзания раствора, немедленно, . без всякой задержки и переохлажде-. ния начнется кристаллизация в растворе, поскольку раствор уже соприкасается с кристаллами льда, торчащими из геля. В результате выделения скрытой теплоты кристаллизации раствора температура внутри контейнеров начнет отставать от температуры камеры 1 и может на какое-то время оставаться на одном уровне. Расхождение показаний датчиков 13 и 14 слу жит сигналом и система 6 программного управления останавливает снижение температуры в камере 1. После выравнивания показаний датчиков 13 и

14 снижения температуры автоматически возобновляется с заданной скоростью в соответствии с дальнейшей программой охлаждения. В большинстве случаев после -40 или -70 С уже

О 40 возможно быстрое замораживание непосредственно в жидком азоте, что улучшает результаты. Поэтому после окончания програкмы медленного охлаждения оператор быстро отсоединяет держатель 7 и погружает -.=г..-о в жнд— кий азот вместе с контейнерамп, если их много и невозможно вс=" снять настолько быстро, чтобы избежать какого-либо подъема температуры внутри них, хотя бы и кратковременного. Затем, после того как контейнеры достигнут температуры азота (-196 С), оператор уже без излишней спешки извлекает их и переносит в 55 специальные хранилища в жидкий азот или в его пары (температура должна быть всегца ниже -140 С).

Таким образом, предлагаемое устройство обеспечивает практически идеальную плавную кристаллизацию в растворах с биологическими объектами без каких-либо, хотя бы и небольших скачков температуры и соответствующих им изменений скорости роста кристаллов льда, а, значит, и скорости обезвоживания клеток, причем весь процесс может быть легко автоматизирован на одном держателе

7 могут находиться контейнеры с различными растворами криопротекторов, имеющих очень разные точки замерзания, и все равно достаточно только одной инициации кристаллизации около -l С) и во всех контейнерах обеспечивается одинаково плавная постепенная кристаллизация„ Иогут быть установлены также отдельные контрольные контейнеры с датчиками

14 для каждой группы ра тв лров с близкигвг точками замерзания. Так как точки замерзания растворов практически всех криопротекторов лежат. нике температуры -1 С и вследствие очень низкой скорости роста кристаллов льда из-за черезвычайно высокой вязкости геля переход кристаллов г раствор, контактирующий с гелем, в момент импульса полностью исключен. Только в дальнейшем ходе процесса после того, как кристаллы льда достгггну г противоположной поверхности геля, .контактирующей с раствором. и после снижения темпегатуры камеры до точки замерзания раствора начнется его кристаллиза" ция, причем без вякого переохлаждения. Это снижение может быть очень медленным: современные программные замораживатели обеспечивают скорость

oxJTBKp,æú я О > 1 С NHH ° Поэтог.гу рост кристаллов будет столь же медленным, с а так как клетки обычно оседают в гыл нюю ч=сг ь коь ° ытгероы 10 при условии расположения контейнеров ,,о под -гглом 0-4 к вертикали кристаллы сначала буцут расти в зоне, где нет iiJI=òÎå и вдали от них ° Тем са мым обеспечивается очень мягкое, постепенное, близкое к идеальному обезвоживанию клеток, при котором потоки воды в наименьшей степени повреждают клеточные мембраны. С другой стороны, когда кристаллы льда все же достигают клеток„ последние уже будут цостаточно обеэвожены,что

° 1522005 полностью исключит губительную кристаллизацию внутри клеток.

Таким образом, предлагаемое устройство обеспечивает повышение сохранности замораживаемых биологических объектов.

Формула изобретения

Составитель И.Шабалина

Редактор Ю.Середа Техред N.Дидык Корректор А Обручар

Заказ 6946/36 Тираж 462 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул, Гагарина, 101

1. Устройство для замораживания живых биологических объектов в контейнерах, содержащее камеру замораживания, систему подачи криоагента в камеру с исполнительным органом, связанным с системой программного управления, систему измерения температуры в камере и контейнерах, установленный в камере держатель контейнеров, выполненный в виде тонкостенной трубки, систему подачи жидкого криоагента к держателю с размещенным на трубопроводе исполнительным органом, о т л и ч а ю щ е е с я тем, что, с целью повышения сохранности замораживаемых биологических объектов, держатель имеет выступы, а контейнеры снабжены пробками, имеющимн поперечную перегородку, выполненную под ней полость и фиксирующие элементы для крепления на указанных выступах с обеспечением контакта между ними и перегородками, При этом полости пробок заполнены нетоксичным водным гелем.

2. Устройство по п.1, о т л и ч аю щ е е с я тем, что, с целью упрощения конструкции, исполнительный орган в системе подачи жидкого криоагента к держателю представляет собой электромагнитный клапан.