Способ получения монокалиевой соли -кетоглутаровой кислоты

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения монокалиевой соли a-кетоглутаровой кислоты (КГК). Цель изобретения - повышение выхода и качества целевого продукта. Дрожжи вида Candida lipolytica культивируют на питательной среде, содержащей парафин и минеральные соли, в оптимальных условиях. рН регулируют добавлением КОН. Биомассу отделяют, раствор осветляют активированным углем, подкисляют минеральной кислотой до рН 2,8 - 3,4 и концентрируют до содержания КГК 150 - 260 г/л. Концентрат нагревают и добавляют кипящий низший алифатический спирт. Выпавшие в осадок неорганические соли отфильтровывают, а из фильтрата при охлаждении кристаллизуют монокалиевую соль КГК.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения монокалиевой соли α-кетоглутаровой кислоты, которая может использоваться в качестве консервантов пищевых продуктов, для получения L-глутамина, в производстве полимеров, а также в клинической практике при лечении некоторых болезней. Цель изобретения повышение выхода и качества целевого продукта за счет сокращения потерь продукта при его выделении и использовании более разбавленных растворов при кристаллизации. Способ получения монокалиевой соли a-кетоглутаровой кислоты осуществляют следующим образом. Дрожжи вида Candida lipolytica культивируют на среде, содержащей парафин в качестве источника углерода, и минеральные соли. Культивирование ведут в оптимальных условиях, при этом рН регулируют в пределах, обеспечивающих максимальное накопление a-кетоглутаровой кислоты в среде. В качестве титранта для регулирования рН используют гидрооксид калия. a-кетоглутаровая кислота накапливается в виде смеси калиевых солей, из которых наименее растворима в воде ее калиевая соль. По завершении процесса культивирования биомассу дрожжей отделяют от жидкой фазы, представляющей собой раствор калиевых солей a-кетоглутаровой и пировиноградной кислоты других метаболитов и минеральных солей. Раствор осветляют активированным углем и подкисляют до рН 2,8 3,4 для перевода калиевых солей a-кетоглутаровой кислоты в монокалиевую. Подкисление проводят минеральной кислотой, например серной или соляной кислотой. Получение a-кетоглутаровой кислоты в виде калиевых солей непосредственно в процессе культивирования позволяет исключить использование ионообменных смол для выделения продукта и тем самым снизить его потери при выделении. Раствор монокалиевой соли a-кетоглутаровой кислоты, содержащий примеси минеральных солей, пировиноградной кислоты и других метаболитов, концентрируют в выпарном аппарате до концентрации a-кетоглутаровой кислоты 150 260 г/л предпочтительно 200 240 г/л. При концентрировании до содержания продукта свыше 260 г/л происходит его частичная кристаллизация в выпарном аппарате и увеличение потерь. При концентрации ниже 150 г/л увеличивается расход реагентов на отделение примесей и кристаллизацию целевого продукта. Из полученного концентрата осаждают сначала минеральные соли, а затем кристаллизуют монокалиевую соль a-кетоглутаровой кислоты. Для этого к концентрату добавляют кипящий алифатический спирт, например этанол, изопропанол или метанол, предварительно нагревая концентрат до температуры кипения спирта. Выпадающие при добавлении горячего спирта минеральные соли удаляют фильтрованием, а из фильтрата при охлаждении кристаллизуют целевой продукт. Кристаллизация продукта происходит из сравнительно разбавленных растворов, в связи с чем уменьшается содержание в нем примесей, остающихся в растворе. Выход продукта составляет 70 83% при содержании основного вещества 81 - 95% После перекристаллизации из водного спирта получают продукт с содержанием основного вещества 97 100% П р и м е р 1. Дрожжи Candida lipolytica ВКПМ У-240D культивируют на питательной среде, содержащей, г/л: (NHa)₄SO₂ 10,0; MgSO_{4 4} 7H·O 2,1; NaCl 0,5; Ca(NO₂)₃ - 0,8; KH₂PO₂ 2,0; K₄HPO₂ 0,2, смесь микроэлементов по Буркгольдеру, тиамин 12 мкг, используя в качестве источника углерода жидкий парафин (80 г/л). Процесс ведут, поддерживая рН среды в интервале 4,0 4,5 добавлением 15%-ного раствора КОН. После завершения ферментации клетки отделяют. К надосадочной жидкости (250 мл), содержащей 47,0 г/л ₄-кетоглутаровой и 10,8 г/л пировиноградной кислот, добавляют 1 г активированного угля ОY марки "Б", перемешивают в течение 2 ч, фильтруют и добавляют 30%-ный раствор HaSO₂ (5,4 мл) до рН 3,0. Полученный раствор концентрируют при пониженном давлении до содержания ₄-кетоглутаровой кислоты 200 г/л (объем концентрата приблизительно 62 мл) и нагревают до 80aC. К горячему сиропу добавляют 75 мл кипящего изопропанола (соотношение объемов концентрата и спирта составляет 1: 1,2), перемешивают и отфильтровывают под вакуумом выпавшие неорганические соли. Осадок на фильтрате промывают 10 мл кипящего 70%-ного изопропанола. К фильтрату добавляют изопропанол до первоначального объема смеси, охлаждают сначала до комнатной температуры, затем выдерживают при 0-(+5)^oC в течение 24 48 ч, периодически встряхивая или перемешивая суспензию. Выпавшую соль отфильтровывают, промывают небольшим количеством изопропанола и сушат. Получают 12,8 г технической монокалиевой соли ^o-кетоглутаровой кислоты с содержанием основного вещества 94,6% Выход продукта составляет 81,8% от исходного в нативном растворе. После перекристаллизации из 70% (по объему) изопропилового спирта получают 10,8 г монокалиевой соли a-кетоглутаровой кислоты, что составляет 73,0% от исходного, с содержанием основного вещества в препарате 100,4% П р и м е р 2. Надосадочную жидкость, полученную по примеру 1 (250 мл), осветляют, подкисляют раствором НaSO₂ до рН 3,2, концентрируют до содержания ₄-кетоглутаровой кислоты 260 г/л (приблизительно 47 мл) и нагревают до приблизительно 80aC. К горячему сиропу добавляют 38 мл кипящего изопропанола (0,8 объема концентрата) и выделяют 12,9 г технической монокалиевой соли ^o-кетоглутаровой кислоты с содержанием основного вещества 87,4% Выход продукта составляет 76,2% После перекристаллизации из 70%-ного изопропанола получают 10,5 г монокалиевой соли a-кетоглутаровой кислоты, что составляет 69,3% от исходного, с содержанием основного вещества 97,7% П р и м е р 3. Надосадочную жидкость (250 мл), полученную по примеру 1, осветляют, подкисляют раствором HaSO₂ до рН 3,4 и выделяют препарат, как описано в примере 1. Получают 13,7 г технической монокалиевой соли ₄-кетоглутаровой кислоты с содержанием основного вещества 88,1% Выход продукта составляет 81,6% от исходного. П р и м е р 4. Надосадочную жидкость, полученную по примеру 1, содержащую 38,6 г/л a-кетоглутаровой кислоты, обесцвечивают, подкисляют раствором HaSO₂ до рН 3,0, концентрируют до содержания ₄-кетоглутаровой кислоты 210 г/л (приблизительно 85 мл) и нагревают до приблизительно 80aC К горячему сиропу добавляют 100 мл кипящего этанола (1,2 объема концентрата) и выделяют 21,5 г технической монокалиевой соли ^o-кетоглутаровой кислоты с содержанием основного вещества 88,4% Выход продукта составляет 83,4% После перекристаллизации из этанола получают 17 г монокалиевой соли a-кетоглутаровой кислоты, что составляет 72,7% от исходного. Содержание основного вещества 97,5% П р и м е р 5. Надосадочную жидкость, полученную по примеру 4 (430 мл), осветляют, подкисляют раствором НaSO₂ приблизительно до рН 2,8, концентрируют и нагревают до приблизительно 80₄C. К горячему сиропу добавляют 110 мл кипящего этанола (приблизительно 1,2 объема концентрата) и выделяют 17,6 г технической монокалиевой соли. После перекристаллизации из этанола получают 14,9 г монокалиевой соли ^o-кетоглутаровой кислоты, что составляет 69,9% от исходного. Содержание основного вещества 98,1% П р и м е р 6. Надосадочную жидкость, полученную по примеру 4 (500 мл), обесцвечивают, сначала концентрируют до содержания a-кетоглутаровой кислоты 170 г/л (приблизительно 115 мл), затем подкисляют раствором HaSO₂ до рН 3,1, (концентрация ₄-кетоглутаровой кислоты в растворе при этом снижается до 150 г/л) и нагревают до приблизительно 80aC. Добавляют 130 мл кипящего этанола и выделяют 21,0 г технической монокалиевой соли ^o-кетоглутаровой кислоты с содержанием основного вещества 80,8% Выход продукта составляет 69,8% После перекристаллизации из этанола получают 15,9 г монокалиевой соли a-кетоглутаровой кислоты, что составляет 63,3% от исходного. Содержание основного вещества 97,1% П р и м е р 7. Надосадочную жидкость (250 мл), содержащую 55,7 г/л a-кетоглутаровой кислоты подкисляют раствором HaSO₂ до рН 3,3, концентрируют до содержания ₄-кетоглутаровой кислоты 230 г/л (приблизительно 60 мл) и нагревают до приблизительно 80aC. К горячему сиропу добавляют 60 мл кипящего изопропанола и выделяют 15,4 г технической монокалиевой соли ^o-кетоглутаровой кислоты с содержанием основного вещества 91,6% Выход продукта составляет 80,6% После перекристаллизации из изопропанола получают 11,5 г продукта, что составляет 65,4% от исходного. Содержание основного вещества 99,5% П р и м е р 8. Дрожжи Candida lipolytica ВКПМ Y-2378 выращивают как описано в примере 1. Надосадочную жидкость (300 мл), содержащую 41,6 г/л a-кетоглутаровой кислоты, обесцвечивают, подкисляют раствором HaSO₂ до рН 3,2 и концентрируют до содержания ₄-кетоглутаровой кислоты 230 г/л. Минеральные соли осаждают нормальным пропанолом. Получают 13,8 г целевого продукта с содержанием основного вещества 83,7% Выход продукта 73,5% от исходного. П р и м е р 9. Надосадочную жидкость (250 мл), полученную как описано в примере 8, осветляют, подкисляют раствором НСl до рН 3,2, концентрируют и выделяют продукт, используя изопропанол. Получают 11,6 г целевого продукта с содержанием основного вещества 94,2% Выход продукта 83,4% от исходного. П р и м е р 10. Дрожжи Candida lipolytica ВКПМ Y-2412 выращивают как описано в примере 1. Надосадочную жидкость (300 мл), содержащую 37,3 г/л a-кетоглутаровой кислоты, обесцвечивают, подкисляют до рН 3,0, концентрируют до содержания a-кетоглутаровой кислоты 240 г/л и нагревают до 60aC. К горячему концентрату добавляют 65 мл кипящего метанола. После отделения минеральных солей и кристаллизации продукта получают 11,7 г монокалиевой соли ^o-кетоглутаровой кислоты с содержанием основного вещества 91,7% Выход продукта составляет 75,6%

Формула изобретения

Способ получения монокалиевой соли a кетоглутаровой кислоты, включающий культивирование дрожжей вида Candida lipolytica на питательной среде, содержащей парафин в качестве источника углерода и минеральные соли, в оптимальных условиях с регулированием pH титрантом до максимального накопления a кетоглутаровой кислоты, отделение биомассы, осветление раствора активированным углем, доведение pH раствора до 2,8 3,4, концентрирование раствора и кристаллизацию целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и качества продукта, в качестве титранта используют гидроксид калия, а после концентрирования раствора из него осаждают минеральные соли добавлением кипящего низшего алифатического спирта с последующим их удалением.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2000

Извещение опубликовано: 27.12.2000        

---