Способ получения коллагеназы

 

(Ё

СО>ОЗ СОВЕ I CKVIX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

>я)5 С 12 N 9/64

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) 1343591 (21) 4340904/13 (22) 09.12.87 (46) 07.05.93, Бюл, N. 17 (71) Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов МЗ СССР и Тихоокеанский институт биооргэнической химии Дальневосточного отделения АН СССР (72) И.Ю.Сахаров, Ф.Е.Литвин, А.А,Артюков и Н.Н.Кофанова (56) Авторское свидетельство СССР

N 1343591, кл. С 12 N 9/64, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ

Изобретение относится к биотехнологии, касается препаративной биохимии и может быть использовано для получения очищенной коллагеназы животного происхождения для применения в клеточной биотехнологии, меховой и кожевенной промышленности, парф>омерии и медицине, в научно-исследовательской работе и является усовершенствованием изобретения по авт.св, N 1343591.

Целью изобретения является повышение удельной активности.

Способ заключается в следующем.

Гепатопанкреас крабов Paralithodes

camtschatica или Sriocheir japonica предварительно гомогенизируют в ацетоне при соотношении 1:8-12 и температуре -15-20 С с последующей очисткой ацетоном и н-бутанолом. Удельная активность полученного фермента составляла 93 — 106 единиц на 1 мг белка.

„„50 „„1526226 А2 (57) Изобретение относится к биотехнологии, касается препаративной биотехнологии и может быть использовано для полу>ения очищенной коллагемазы животного происхождения для применения в клеточной биотехнологии, меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии и медицине. Целью изобретения является поьышемие удельной активности. Препарат фермента очищают осаждением сульф;-пом аммония (50-80;(насыщения) с последующей ионообменной хроматографией на

ДЭАЭ-носителе, Причем сорбцию ведут при рН 5-7, а десорбцию — добавлением в буфер

1 моль ИаС!, Затем проводят осаждение сульфатом аммония (50-807, ) с последующей ионообменмой хроматографией на носителе, содержащем дизтилал1иноэгильные группировки, а сорбцию прогодят при рН 5 — 7. Удельная активность полученной колг>агеназ>л достигает

3500-4000 ед./1мг белка (против 93- 106 jQl ед./мг по известному способу). М

Нижняя граница рН обусловлена тем, О что при рНниже 5 наблюдается б».с1рая денатурация коллагеназы. ьэ

Верхняя граница рН обусловле»а том, что при рН выше 7 на ионообменниках сорбиру> ется большое количество балластных г>елков, что резко понижает удельную активность целевого продукта.

Нижняя граница комцек грации (NH4QSO4 обусловлена тем, что при с-епеки насыщения суг>ьфатом аммомич »- llже 50 "г, фермент осаждается кеколичестве>I»о.

Верхняя граница концемтра >ии (>чН4)2504 обусловлена тем, что и> и степени

152Г)226 насыщения соли Выше 80 совместно с коллагеназой соосаждается большое количество балластных белков, Составитель В.Варламов

Техред M.Mîðãållòaë Корректор Л.Ливринц

Редактор

Заказ 1972 Тираж Подписное

ВНИИПИ государственного комитета rio изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-1 .здательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

П р Il M е р 1. 3 г коллагеназы краба с активность1О 100 ед./мг белка растворяют в

50 мл 0,2 M фосфатного буфера, рН 7,9, при комнатной температуре и центрифугируют при 300009 в течение 30 мин. Полученный осадок повторно растворяют в 35 мл того же буфера. Затем супернатанты обьединяют. К полученному раствору коллагеназы при 4ОС добавля1от (ИН4)2504 до t30 от насыщения и инкубируют в течение 1 ч, Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, а затем растворяю1 в 10 мл 20 мм ацетатного буфера, рН 5, L1 дважды диализуют против того же буфера. Раствор коллагеназы наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой CLGB

Pharmacta (9y180 мм), уравновешенной 20 мМ ацетатным буфером, рН 5, Фермент элюируют тем же буфером. содержащим 1 моль NaCI. Фракции, содержащие коллагенаэную активность, обьединяют, диализуют протиВ дистиллирое1анно11 воды и лиофили зуют. Удельная активность коллагеназы краба равна 4000 ед./мг белка.

Пример 2. Очистку коллагеназы проводят аналогично примеру 1, однако осаждение ферме11та проводят 50 -ным по насыщению (М ln)2S0«, а при ионообменной хроматографии использу1от ДЭАЭ-сферон

"Chemapol", уравновешенный 50 мМ трисHCl, рН 7. Удельная активность полученного препарата коллагеназы 3890 ед,/мг белка, "0 Пример 3, Очистку коллагеназы проВодят аналогично примеру 1, однако осаждение фермента проводят 80 -ным по насыщению (МН4)2501, а и ри ионообменной хроматографии используют ДЭАЭ-сферонит ВНИИ особо чистых Веществ, уравновеше11ный 20 MM ацетагным буфером, рН 5.

Удельная активность получе п1ого и репарата коллагеназы 3500 ед./мг балка.

Формула изобретения

20 Способ получения коллагеназы по эвт,св.

%1343591,отл ич а ю щи йс ятем, что,c целью повышения удельной активности, очистку препарата проводят осаждением 5000 -ным по насыщени1о сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на ДЭЛЭ-носителе, при 1ем сорбцию ведут в буфере при рН 5-7, а десорбцию тем же буфером, содержащим 1 моль МаС!.