Способ определения морозоустойчивости пшеницы

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции пшеницы при создании морозоустойчивых сортов. Целью изобретения является повышение достоверности и точности при сокращении времени определения морозоустойчивых растений. Растения последовательно подвергают обработке температурами, соответствующими первой и второй фазами закаливания, затем из апикальных меристем готовят давленые препараты, окрашенные по Фельгену, и определяют соотношение ДНК в фазах клеточного цикла G<SB POS="POST">1</SB>+S и G<SB POS="POST">2</SB> фазе. 1 табл.

СООЗ СоаЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5П 4 А 01 Н 1/04! rl т;, „,,,::, УН17 ,,а

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЙ

К АBTÎPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4261968/31 — 13 (22) 02.06.87 (46) 15 ° 12 89. Бюл. Н 46 (71) Всесоюзный научно †исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии (72) Н.В.Кононенко и В.А.Кадыков (53) 5?5.633. 112.1(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 967392, кл. А 01 С 7/00, 1982. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть испольэоваИзобретение относится к биотехнологии, в частности селекции сельскохозяйственных растений, а также экспериментальной биологии и может быть использовано для определения мороэоустойчивости пшеницы.

Цель изобретения — повышение достоверности и точности анализа, а также сокращение времени определения.

Способ включает проращивание зерновок, воздействие низкой температурой и цитофотометрический анализ на содержание ЛНК в ядрах меристемы, при этом на четырехсуточные проростки последовательно воздействуют пониженной температурой +4 и -4 С, затем выделяют апикальные меристемы побегов, окрашивают их по Фельгену, готовят давленые препараты, проводят цитофотометрический анализ при 550 нм и по соотношению количества ДНК в ус— тойчивых фазах клеточного цикла (С, +

„„SU„„1528395 А 1 но в селекции пшеницы при создании морозоустойчивых сортов. Цель изобретения — повышение достоверности и точности при сокращении времени определения морозоустойчивых растений. Растения последовательно подвергают обработке температурами, сп— ответствующими первой и второй фазам закаливания, затем иэ апикальных меристем готовят давленые препараты, окрашенные по Фельгену, и опредепяют соотношение ДНК и фазах клеточного цикла 0 + S и фаз" С .

1 табл.

+ S) и чувствительной к действию низких температур фазе (G ) судят о сте- С пени морозоустойчивости.

Важным моментом способа является выбор в качестве объекта исследования апикальной меристемы побега. Апикальная меристема побега более чутко реагирует на снижение температу- р ры по сравнению с корнем, который в естественных условиях находится в почве, поэтому его чувствительность на низкие температуры невысока. Апи- 1 О кальная меристема побега является Ql главной среди образовательных тканей, она обеспечивает морфогенез ра— стения, дифференцировку тканей, регулирует клеточный цикл. Изменение фазового состояния апиклльной меристе— мы побега при снижении температуры может служить критерием степени устойчивости растений.

При низких температурах у пролиферирующих клеток затормаживаются

1528395

30

tI жизненные процессы, наблюдается за- тухание деления, основная масса кле ToI находится в инте рфа з е — н аиболеа продолжительной фа зе митоти5 ческог о цикла. Интегральную оптическую плотность окрашенных по Фельгену интерфазных ядер измеряют в трех фазах: в пресинтетической фазе (С,), в которой идет подготовка клетки к синтезу 11НК; в синтетической фазе (S), когда осуществляется синтез .

ДНК; в постсинтетической фазе (G,), в,ечение которой клетка переходит к делению.

Ядра соматических клеток предсинтетической фазы характеризуются диплоидным количеством ДНК (2С), ядра цостсинтетической фазы — тетраплоидным количеством ДНК (4С), ядра синтетической фазы — промежуточным количеством ДНК (2С вЂ” 4С).

Критерием диплоидного количества

ДНК служат телофазные ядра, находящиеся в процессе деленияp которые 25 содержат 2С IIHK, а тетраплоидного метафазные ядра, содержащие 4С ДНК.

Учитываются как наибЬлее устойчивые фазы — предсинтетическая и синтетическая (С1 и S) так и самая чувствительная постсинтетическая (С ) (Гродэинский Д.М., Хилько Т.Д;, Белецкая Е. К. Критика клеточной популяции меристемы стебля озимой пшеницы после действия отрицательной температуры, — В кн.: Клеточный 35 цикл растений, Киев, 1983).

Выбор пониженных температур в наших опыгах соответствует прохож! дению растениями I фазы закаливания (+4 С) í II фазы закаливания (-4 С) в естественных условиях.

Способ осуществляют следующим образом.

Зерновки разных сортов пшеницы, раэличаюпэжся по степени морозоустоичивости, проращивают при 20 С, а затем последовательна выдерживают при

4 и -4 С. После прохождения цикла низких температур из проростков вы— деллют 8-10 меристем побега и фик- 50 сируют их в смеси этанол-уксусная кислота. Образцы подвергают гидролпзу в 1 н.ПГ1, окрашивают реактивом шиффа (фуIIOIIHcpрнистая кислота), коTopb1II взаимодействует с ДНК, обра 3$ я окрашенный в густо-фиолетовый пнет комплекс ДНК-фуксин, по содержанию которого в Rпре судят о суммарном количестве ДПК.

Интегральную огти 1ескую плотность окрашенных ядер измеряют на сканирующем цитоспектрофотометре СМП-03.

Для анализа отбирают 60-70 ядер в каждом варианте. Коэффициент мороэоустойчивости рассчитывают как отношение количества ДНК в ядрах в фазах

G и Ы к их количеству в фазе С .

Выбранный режим проращивания можно обосновать следующим образом. На четвертые сутки в апикальной меристеме побега наблюдается наибольшее количество митозов (делящихся клеток), у трехсуточных проростков митоз наблюдается, но в очень незначительной степени и на давленых препаратах почти не виден, у пятисуточных проростков наблюдаются следующие волны митоза и помимо удлинения сроков анализа, что нецелесообразно, падает также достоверность получаемых результатов.

Кроме того, температурный режим и режим проращивания выбран в соответствии с фазами закаливания. Пергая фаза закаливания находится в интервале 0-6 С, вторая — -2 до -5 С. о O

Температурный режим и время выдержки установлены эмпирически.

Пример ы 1-4. Зерновки сортов озимой пшеницы — Ульяновка (высокоморозоустойчивый сорт), Мироновская 808 (морозоустойчивый сорт), Карлик краснодарский (среднеморозоустойчивый сорт), Московская 35 (неморозоустойчивый сорт) — проращивао ют последовательно 4 сут при 20 С, затем 4 сут при 4ОС, 2 сут при -4 С о и 1 сут при +4 С. После прохождения цикла понижающихся температур из проростков выделяют клетки апикальной меристемы побега и фиксирУют их в смеси этанол-уксусная кислота (3: 1) о г течение 3 ч при 4 С ° Материал проводят последовательно через серию спиртов различной концентрации до воды (70, 50, 307, вода). Образцы подвергают гидролизу в 1 н.НС1 в те ение 40 мин при 50 С, окрашивают о реактивом Шиффа (при 4 С в течение

6 ч), получая при этом окрашенные в густо-фиолетовый цвет комплексы ДНКфуксина. Не вошедший в реакцию краситель отмывают в свежих сернистых водах, обрабатывают 0,2Х-ным раствором целлюлизина для удаления клеточных оболочек, мацерируют в 40Х-но уксусной кислоте и готовят постоянные

Суммарное содернание ДНК-фуксина в ядрах апнкальной мернстемы побега в эависнмости от сорта и коэффициента нороэоустойчивости уммарное содернание ДНКуксина в фавах клеточноо цикла, усл.ед.

Сорт

Коэффициент мороэоустойчивостн

Степень мороэо устойчивости по предлагаемопо сравниваемому способу по авт,св

II 967392

c,+s с му способу

Высокомороэоустойчивый сорт Мороэоустойчивый сорт

Среднемороэоустойчивый сорт

Немороэоустойчивый сорт

43 2454 75 10,38t0 83 3 8 4 6

Ульячлнка

Мироновская

808

Карлик краснодарский

О, 8-0 ° 9

32,3713,24 13,8611,24 2,2-2,6 0,7-0,8 0,9-1,0

25,70t2 83 13,91t1,11 1,6 2,0 0,8-0,9 1,0-1,1

Московскал 35 20,99+2,10 33,67t3>70 0,6-0,7 1,6-1,7

1,1-1,3

5 15283 препараты с помощью жидкого азота и бальзама.

Интегральную оптическую плотность окрашенных ядер измеряют на сканирующем цитоспектрофотометре СПМ-03.

Коэффициент мороэоустойчивости рассчитывают как. отношение количества

ДНК в ядрах в фазах G u S к их количеству в фазе G2.

Полученные данные представлены в таблице.

Пля доказательства существенности режима выращивания проростков проведены сравнительные опыты 5-7 в ко15 торых используют режим выращивания по прототипу.

Пример ы 5-7 (сравнительные).

Зерновки пшеницы сортов Мироновская

808 Безостая 1, Московская 35 про° э о ращивают раздельно 10 сут при 4 С и 27 ч при 20 С. Отделяют кончики корешков (1-1,5 мм) и далее следуют методике, приведенной в примерах 25

1-4 . Коэффициент мороэоустойчивости рассчитывают по отношению содержания

ДНК в ядрах клеток, выращенных при

20 и 4 С.

Полученные данные представлены в таблице.

Предлагаемый способ позволяет более четко разделять близкие по морозоустойчивости сорта (морозоустойчивый сорт Мироновская 808 отличается от высокоморозоустойчивого сорта З5

Ульяновка в 1,7-1,8 раза, тогда как по известному способу это различие составляет всего 0,1); сократить время проведения анализа и объем исследуемого материала (по сравнениО с способом-прототипом) более чем вдвое, так как для вычисления коэффициента морозоустойчивости используют растения одного режима выращивания вместо двух. Достоверность определения повышается эа счет того, что для анализа берется апикальная меристема побега, фазовое состояние которой более специфично на влияние низких температур чем у корневой меристемы.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ определения морозоустойчивости пшеницы, включающий проращивание эерновок, воздействие низкой тем— пературой, цитофотометрический анализ на содержание ДНК в ядрах меристемы, отличающийся тем, что, с целью повьпаения точности и достоверности анализа, а также сокращения времени определения, на четырехсуточные проростки последовательно воздействуют пониженной температурой, соответствующей температурам первой и второй фаз закаливания, затем выделяют апикальные меристемы побегов, окрашивают их по Фельгену, готовят давленые препараты, проводят цитофотометрический анализ при длине волны, соответствующей максимальному поглощению излучения реактива Шифа и по соотношению количества ДНК в устойчивых фазах точного цикла и чувствительной к действию низких температур фазе судят о степени морозоустойчивости.