Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент моноклонального антитела, нейтрализующего биологическую активность человеческого фактора некроза опухолей-альфа

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения и нейтрализации фактора некроза опухолей = альфа (ФНО=α). Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО=α с повышенной нейтрализующей способностью в отношении клеточного ФНО=α. Штамм получен путем иммунизации мышей линии BALB/C рекомбинантным ФНО=α. Далее гибридизуют клетки селезенки миеломы мыши Х63=AG8=653 и затем проводят селекцию и клонирование. Получают штамм 3C7N, который депонирован под номером ВСКК(П)N170Д. Штамм продуцирует монАТ JGG1, специфичность - ФНО=α. МонАТ штамма 3C7N нейтрализует как рекомбинантный, так и клеточный ФНО=α, при этом в случае рекомбинантного ФНО=α необходимо разведение асцита 1:1600, в случае клеточного 1:2400. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А1

„„SU,„, 521776 (51)4 C 12 N 15/00 А 61 К 39 395

3 БОЯЗНЕ :Кс;1й,"3 Е13ИБЯ6

Е. Gi -:1ОТЕ А

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЦЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4352390/31-13 (22) 29. l2.87 (46) 15. 11.89. Бюл. Р 42 (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови

Институт молекулярной биологии AH СССР и Институт биоорганической химии им. М.M. Шемякина (72) А.В. Панютич Н.Н. Войтенок, P.Ë. Турецкая, А.Й . Шахов, С.А. Недоспасов, С.А. Чувпило, Л.Н, Шингарова, В.Н ° Добрынин и В.Г. Коробко (53) 578.085.23(088.8) (56) Liang С.M. ес. al, Biochem, BiopI lujs. Нея. Comm. 1986, v. 137, р.847854. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS NUSCULUS-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА, НЕАТ. РАЛИЗУЮЩЕГО БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕИ-АЛЬФА

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения и нейтрализации фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-о().

Цель изобретения — получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО-e(с повышенной нейтралиэующей способностью в отношении клеточного ФНО-с4

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BaLb/Ñ иммунизируют

rro 2-недельной схеме. 20 мкг Р ФНО-ot (рекомбинантный фактор некроза опухо2 (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения и нейтрализации фактора некроза опухолей-ал ьфа (ФНО-о() . Цель изобретения — получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО- с(с повышенной нейтралиэующей способностью в отношении клеточного ФНО-О(. Штамм получен путем иммунизации мышей линии

BaLb/Ñ рекомбинантным ФНО-a(. Далее гибридизуют клетки селезенки миеломы мыши ХЬ3-Ая8-Ь53 и затем проводят селекцию и клонирование. Получают штамм 307N который депонирован под номером ВСКК(П) Р 170D. Штамм продуцирует монАТ .IgG1, специфичность

ФНО-ot. МонАТ штамма 3C7N нейтрализует как рекомбинантный, так и клеточный

ФНО-с(, при этом в случае рекомбинантного ФНО- 4 необходимо разведение асцита 1: 1Ь00, в случае клеточного

1: 2400. 2 табл, лей-альфа) в 0,15 мл 0,15 M NaC1 в смеси с равным объемом полного адъю, ванта Фрейнда дважды вводят внутри- © брюнинно с интервалом в 7 дней. За

3,2 и 1 день до слияния 10 мкг P ФНО- 4 вводят внутрибрюнинно в 0,5 мл

О, 15 М NaC1. Гибридизацию 1, 2х10 кле7 ток селезенки иммунных мышей и 4х10 клеток миеломы мыши ХЬЗ-Ag8-653 проводят 50/-ным раствором полиэтиленгликоля мол. массы 4000, содержащего

57 диметилсульфоксида, в течение

1,5 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля клетки

1521 776

;lü1o е!!як)т 11 9 () .л "нач ныР 1!ян ил!! ПО

1х 70 снленоцито;з в лу нку. Для купьтив)!р<лзан

ISk<.ve Н среда Дул ьбекко) с добавлениемем I 0% эмбриональной теляч ьей с ы1зорот1<и (ЗТС), 10 М 1 и<<оксантина „

4х10 М ямиlloll r pHHa и 1 „Ьх10 " М ти1!!<д1! и с), (! брид ы пр Оду цР н ) ы кл Они!)уют

2 разя методом конечных разведений, нысеlзяя I!0 7 клетке В луllку > содержа щую 4х10 клеток селезенки. После 2 клонирований грактически 100% субкланОВ Ip ojt $ пиру) 1от манокл она льные я нти 75 тела (монАТ) к Р ФНО-

Штамм ЗС7Ы депонирован под номером ВСКК (П) (() 1707:) и характеризует20 ся с !Оду1о<<ц1ми примерами.

Культу ральнь!е признаки.

Стандар "Hb!e условия кулы<ивирования, Cpå»tÿ 1_#_3N с 10% донорской телягьей сыворотки, 2х(0 М 1-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина„ 100 мкг/мл стре1! Ом

С(),I(!1 ë 1)b!p

» )ных: Д!!я в<зря!<(1!Ванин ясцита при! Одны мыши Ба!»Н/С, Мышам зя 7-30 дней до

)!1lъекн;;!!! клетОк !!!тамма вззадя 1 Вну Грибр1о; инно по 0,5 мл пристана. Клетки и

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не Обнару)кеньз при длительном набл!одении и посевах на питательные

4» среды, Заражение микоплазмой Не выяв.!ено при Окрашивании краcblòL»ëëìÿ на

ДН7(и;1о характеру вкл1очения т!1мид!1новой bs<.".Plc:,I, 7)иасинтез полезного продукта, Секреция манок!!онал). Ного антитела на

2-3 день lcyJIJ> IIHHpollaIIHH составляет

11-15 мкг/мл культypaJII ной среды и

6-7 мг в 1 мл асцитнои . ;-;идкости при определении иммунаферментным методом.

Харь!кт ври с 111

<))Ej 0.-. -.(, 1

Методы оценки сохранения специфичности: тест на связывание монАТ с иммобилизированным ФНО- 0 (иммуноферментный анализ) . Антиген сорбируют на пластике: 500 нг в 50 мкл О, 1 М бикарбонатногo буфера, рН 9,6, ночь при 4 С. Затем, после отмывки, наносят тестируемую культуральную среду и после инкубации и отмывки определя-! от количество сорбированных антител мечеными пероксидазой кроличьими анTHMbIIIIHHbMH антителами. Все отмывки проводят бидистиллированной водой.

Контролем служит бычий сывороточный альбум1!н в качестве антигена.

Стабильность продукции. Продукция манАТ сохраняется как минимум до 15 пассажей in vitro, Б асцитной форме штамм не пассировался более одного раза.

Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотIcP с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1 С/мин до минус -70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот, Разморая<иванне на водяной бане при 37ОС, Жизнеспособность клеток после размораживания 60-70% по окрашиванию три" пановым синим, Пример 1. Гибр!!дамные клетки помеШа1от в стеклянный флакон объемом ("

50 мл по 1х10 клеток в 5 мл среды с б

10K ЗТС, 2мМ Е,— PJlèòàì

2-3 дня при 37" С в атмосфере 5% СО .

Полученный супернатант используют в качестве реагента в иммунохимических реакциях.

Тест на определение специфичности взаимодействия манАТ с антигенами, иммобилизированными на пластике.

Используемый метод: иммуноферментныи анализ.

Р ФНО-о,, P ФНО- р и бычий сывороточный альбумин (E)CA) в количестве

0,5 мкг в 50 мкл 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,6, вносят в лунки 96-ячеечных микроплат и сорбиру!от ночь при

4 С. После отмывок в ячейки вносят па 50 мкл культуральной среды штамма

ЗС7И или разведенных 1:5000 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М

NaCl, 1% БСА (ЗФР-БСА) поликланальных кроличьих антител, специфичньп< к Р

ФНО-1)!. Панель инкубируют 2 ч при 20 С, S 15217 затем отмывают 5 раз бидистиллированной водой и вносят по 50 мкл в лунку кроличьи противомьппиные антитела, меченые пероксидазой, разведенные

1/2500 в ЭФР-БСА и меченые пероксидазой противокроличьи антитела, разведенные t/2S00 в ЗФР-БСА. После инкубации в течение 1 ч при 20 С плату отмывают и в лунки добавляют субстрат 10 ортофенилендиамин гирохлоридд,0,6 мг/мл в цитратно-фосфатном буфере, рН 4,7, содержащем 0,03 . Н О . Реакцию останавливают через 10 мин 1 М серной кислоты и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны

492 нм.

Результаты опыта по изучению спе-, цифичности связывания монАТ продуцируемого клетками штамма 307N, с àí- 20 тигенами, иммобилизированными на пласт тике, представлены в табл. 1.

Результаты этого примера свидетельствуют о высокой специфичности монАТ, 25 вырабатываемого клетками штамма ЗС7И, и показывают возможность применения этого монАТ для определения ФНО-Ы с помощью иммуноферментного метода.

Пример 2. Биологическую активность различных образцов ФНО опре30 деляют по лизису клеток мышиной.фибробластоидной линии Ь929 в присутствии актиномицина Д. Накануне теста клетки L929 рассеивают по SO тыс. в лунку в плоскодонные 96-ячеечные мик- 35 роплаты в минимальной среде, модифицированной Дульбекко (ДИЕМ) с 51 ЭТС, глютамином меркаптоэтанолом, пенициллином и стрептоцимином. Образцы, содержащие ФНО, раститровывают в от40 дельной плате в объеме 50 мкл, вносят

50 мкл соответствующего разведения антител и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После инкубации образцы переносят в плату с клетками

L-929, добавляют актиномицин Д до лизис клеток.

Результаты опыта по нейтрализации биологической активности ФНО-ef монАТ штамма ЗС7N представлены в табл. 2.

Данные этого примера свидетельствуют об эффективной нейтрализации биологической активности как рекомбинантного, так и клеточного ФНО-d монАТ штамма 3C7N, при этом в случае р ФНО-а необходимо разведение асцита 1: 1600, клеточного ФНО- с(1:2400. ормула из обретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musuulus ВСКК(П)

N - 170D — продуцент моноклонального антитела, нейтрализующего биологическую активность человеческого фактора некроза опухолей-альфа.

Таблица

Антигены

Кроличья антисыворот. ка 1:5000

А492 xi03

Культурал ьная среда штамма

3C7N, А492 х х 10э

291

2584

481

161

2346

I 10

БСА

ФНО-ал ьфа

ФНО-бета

А492 - оптическая плотность лунок при 492 нм.

76 6 концентрации t мкг/мп и помещают в термостат с температурой 37 С на 1620 ч, Результаты учитываю после окрашивания клеток 0,2Х-ным раствором генцианвиолета в 2 -ном метаноле в течение 10-12 мин. Оптическую плотность лунок измеряют при длине волны

540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом. Лизису клеток Ь-929 соответствует снижение оптической плотности лунок ° 3a единицу биологической активности образцов ФНО принимают то их разведение, которое вызывает 50/ по отношению к интактным

1521 776

Таблица 2

Без антител, монАТ ЗС7

А540 нм х10 асцит

1: 200, A540x f 0

ФНО в кул ь тур е

Кроличья антисыворотка, 1:200, А540нм х 10

1136 t 274

1 123

376

539

676

1186

1417

1 286

1092

1226

1228

404

543

784

1149

979

994

1122

1166

1290

248

413

798

352

583

973

248

527

997

Клеточный ФНО- Ы получен в результате стимуляции периферических мононуклеаров крови человека 5 мкг/мл

ФГА в течение 24 ч при 37 С.

Редактор Н. Киштулинец

3@was 6892/24 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óærîðîä, ул. Гагарина,101

Рекомбинантный

ФНО-с(, ед/мл .

2

Клеточный ФНО-с(, ед/мл

2

Рекомбинантный

ФН О-Р ед/ мп

2

Составитель А. ваныкин

Техред JI.Îëèéíûê Корректор Н ° Король