Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей - альфа человека
Изобретение относится гибридомной технологии и может быть использовано для определения и иммуносорбции фактора некроза опухолей-α человека (ФНО-α). Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО-α изотипа G2B с повышенным титром в асците. Штамм 7G 1 получен путем иммунизации мышей линии BALB/C рекомбинантным ФНО-α. Далее гибридизуют клетки селезенки иммунных мышей и клетки миеломы мыши Х63-AG8-653 и затем проводят селекцию и клонирование. Полученный штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 172D. Штамм продуцирует монАТ JGG2B, специфичность - ФНО-α. Титр асцита превышает 1:1000000. 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН
„„SU > 0
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СОИДЕТЕЛЬСТВУ б:;, . ЗМ
Ф? м ?. ЮНА
1 Р ? е:.<
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4352389/31 — 13 (22) 29. 12. 87 (46) 23.12.89 Бюл. Р 47 (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови и Институт молекулярной биологии
АН СССР (72) А,B.Панютич, Н.Н.Вог?тенок и P.Ë.Турецкая (53) 578.085.23(088.8) (56) Lian! С.М. et a1,Biochem.Biophys.
Res.Comm, 1986, v 137„ р.847-85 (54) ШТАЖ1 ГИБРИДНЫХ К" 1ЬТИИГРУ1 ".NX
КЛЕТОК жИВОтНЫХ mSW Изобретение относится к гибр.-?домной технологии и может быть ? пользовано для определения и иммуносорб.?ии фактора некроза опухолей-п человека (ФНО- oC,). Цель изобретения — получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО- М, изотипа G2b с повышенным титром в асците. Штамм получают следующим образом. Мышей линии BaLb/c иммунизируют по двухнедельной схеме. 20 мкг рекомбинантного ФНО-о< (Р ФНО- о<.) в 0,15 М NaCI в смеси с равным объемом пс:янов го адьюванта Фрейнда дваждь? вчодят внутрибрюшинно с интервалом в . дней, За 3, 2 и 1 день до сг?ияния 10 мкг Р (11 4 С 12 15/00, А 61 К 39/395 (57) Изопрете???ле отное ?т< гибрид нои техно ., гни и может бьг, — использоВано для оп? еде?!
G2b с повьппенным титром в асците. Г1тамм 7С1 получен путем иммунизации ? .<.?шей:??нии Вз1.Ь / рекомбинантным <1 i?0--,»: . Пал е г? б, ияи..: .ю ?<лс тки селе<ен сг? иммунн,л ?л?,п«й и к?етк!< .?Heëoèû мьпп?л Х63- <<-; 8-: 53 и з . <..и провог?ят се<не?;ц?ъч;<р,>ва???е,, o;òv÷ ?<ньпл / 1Т шта?г?? д
17 T), Штамм г одуцирует монАТ а l Я ?р< Ь, сп< ци p!? ??«>o г — ФНО- -, Титр -с?-,ита превышает I: 10000< О. 2 табл, lemL ФНО-; звог?ят внутрибрюши??но ь 0,5 мл ЯД О. 15 <1 Ча<.1 Гиб-.я?пг? .a?????
1 клс. <с;к слезеHKH мму;?ных мьппе?л и -,х <0 клеток м?л.ломы мьппи Х63-Аув-653 «ау проводят 50,,-???<л раствором г?олиэтиленгликоля мол.массы 000, содержащего 5 . ;.иметилсульфокс??да, в течение 1, 5 мин. После ".,!.ридизации и отмь?вKH oò полнэтиленгликоля клетки высеГ вают в 96-лу??оч??г?е панели па 1 х 10 спленоц<лтов в ?у??ку. Для культивирова?<и?я и селекции гибридом используют йь среду I_#_?. 1 (модифиц.?рованная Iskove s c, да Дул?.бек«.о1 с добавлением 107 эмбриональной телячъеи сыворотки (ЭТС), 10 И гглпоксантина, 4 х 10 М аминопте-Ф рина и " 6 х 1 > «11 тими: ина. Гибридные 1530638 продуценты кло,»I i.ют раза ме ол .и конечных разведений. высекая по 1 4. клетке в лунку, содержащую 4 х 10 клеток селезенки. После двух клониро5 наний практически 100 субклонов продуцируют AT к P ФНО- oi Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 15 пассажей в культуре. Полученный штамм 7Г 1 депонирован под номером ВСКК(П) Ф 172D и характеризуется следующими признаками. Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования, Среда IMDM с 10Х донорской телячьей сыворотки, 2 х 10 И L-глутамина, 100 мкг/мл Ф пенициллина, 100 мкг/мл стрептомици-4 на, 0,05 х 10 ll меркаптозтанслз, при 37 С и н атмосфере 57 СО„., 1II÷ выращивания штамма испсльзуют стеклянную посуду, посевная доза 100-200 тыс, клеток на 1 мл, кл тки пассируют 1 раз в 2-3 дня,кратность рассена 1:6-1;8„ Культура суспензионная ° Культивирование рганизме живот- 25 ных. Для выращивания а цита пригодны мьппи BALB/ñ.,1ышам за -30 дней до инъекции клеток шт; а вводFIT внутрибрюшинно по 0,5 мл прис" ан», Квот,:и инъецируют нну грибрюшин « и,; 2-5 х х 10 клеток ь 1 гл среды .LlfD1!. Лсцит формируется через 12-14 дней, Биосинтез полезног;1 продуIIга„Секреция моноклональног- антитела (ИНАТ, на 2-3 день культивг ронания состанля35 ет 25-30 мкг/мл культура.II;IInI3 реды и 7 — 8 мг в 1 мл »IIII ной ж д о ти при определении иммун,»>-.рментцыч . 1 годом. Характеристиь.а по тученного продукта. Штамм продуцирует моноклональное 40 антитело IgG2b. Специфичность — ФНО-о . Иетоды оценки сохранения специфичности; тест на связывание с иммобилиэованным ФНР.-О4(иммунг ферментный анализ). 45 Антиген сорбируюг на плзсгпк . 500 нг в 50 мкл 0,1И бикарбонатного буфера, рН 9,6, ночь при 4 С. Затем о, после отмывки наносят тестируемую культуральную среду и после инкуба50 ции и отмывки определяют количество сорбированных антител меченньггн пероксидаэой кроличьими антимьипиннми антителами. Все отмывки проводят бидистиллированной водой. Контролем служит 55 бычий сывороточный альб}ж . н качест- ве антигена. Стабильность пр< дукции. Продукция монАТ сохраняется как минимум до 15 пас«, и i» 1г о. В асц штамм не влссироналс я бол. п :n""n раза. Контаминация, Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимидиноной метки. Криоконсервиронание, Для длительного хранения клетки штамма замораживают н эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 107 диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1 С/мин о до -70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяной бане при 37 С. Жизнео, способность клеток после размораживания 65-707. по окрашиванию трипановым синим. Пример 1. Гибридомцые клетки помещают н стеклянньп флакон объемом 50 мл по 1 х 10 клеток в 5 мл среды б с 107. ЭТС, 2 мИ сь -глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина. 0,05 м | меркаптоэтанола, Клето ки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере .",, . СО . Полученный супернатант используют н качеств» ppагpнта в иммунохпмическпх реакпцях (как репарат монАТ). Тест н» определение специфичности нзгимодействия МоНАТ с ацтигенами, иммобилизонанными на пласгик», Нспользуеиый метод: нм.:уноферментный анализ. Р ФНО- К, Р ФНО- и бычий сывороточный альбумин (БСА) в количестве 0,5 мкг н 50 мкл 0,1 M карбонатного буфера рН 9,6, вносят в лунки 96-ячеечных микроплат и сорбируют ночь при 4 С. После отмывок в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды штамма 761 или разведенных 1:5000 н 0,01 И фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 И ИаС1, 17 БСА (ЗФР-БСА) поликлональных кроличьих антител, специфичных к Р ФНО- о4 . Панель инкубируют 2 ч при 20 С, затем отмывают 5 раз бидистиллированной водой и вносят по 50 мкл/лунку кроличьи противомышиные антитела. меченные пероксидазой, разведенные 1/2500 н ЗФР-БСА, и меченные пероксйдазой протинокроличьи антитела 1/2500 в ЗФР-БСА, После инкубации в течение 1 ч при 20 С плату отмывают и в лунки 15306 добавляют субстрат — ортофенилендиамингидрохлорид, 0,6 мг/мл в цитратно- . фосфатном буфере рН 4,7, содержащем 0,03 Н, О, Реакпию останавливают через 10 мин 1 М серной кислотой и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм. Результаты опыта по изучению специфичности связывания монАТ, продуцируемогс клетками штамма 7С1, с антигенами, иммобилизированными на пластике, представлены в табл.1. Результаты этого примера свидетель-15 ствуют о высокой специфичности монАТ, вырабатываемого клетками штамма 7G1, и показывают возможность применения этого монАТ для определения P ФНО- < с помощью иммуноферментного метода. 20 38 б в плоскодон> е 96-я тесаные михроплаты в полной среде ДМЕМ. Образцы ФНО >аститровывают в отдельном планшете в объеме 100 мкл, затем переносят в плату с,клетками 1929, добавляют актиномицин D до концентрации 1 мкг/мл н помещают в термостат с температурой 37 С на 16-20 ч. Результаты учитывают после окрашивания клеток 0,2 -ным раствором генцианвиолета в 2 -ном метаноле в течение 10-12 мин ° Оптическую плотность лунок измеряют при длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом. Лизису клеток 1929 соответствует снижение оптической плотности лунок. Результаты опыта по сорбции Р ФНО- oL монАТ штамма 7С1 представлены в табл.2. Штамм гибридных культивируемых клеток животных MusmuscuIus BCKK(H) У 172D — продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей— альфа человека. Данные табл.1 показывают, что монАТ 7С1 из культуральной среды гибридомы взаимодействуют с ФНО- о,практически одинаково с кроличьей антисывороткой в разведении 1:5000 (2563 и 2584 соответственно). Специфичность связывания монАТ с ФНО-Ы при этом выше, чем у поликлональных антител (по отношению к связыванию с БСА и ФНО- p ) . 30 Пример 2. Сорбция Р ФНО-с монАТ штамма 7GI, К 1 мл Бра-сeфapoзы 4В добавляют 1 мл кроличьей антисыворотки к иммуноглобулинам мыши и инкубируют I ч при комнатной температуре. Несвяэавшиеся антитела отмывают 0,05 М трис-НС1, 0,15 М ИаС1,, рН 7,4 (ТБР) путем многократного центрифугирования, 0,3 мл полученного сорбента смешила- 40 ют с 5 мг сульфатной фракции асцита гибридомы 7G1, инкубируют на горизонтальной качалке 1 ч при комнатной температуре, заполняют гелем микроколонку из пастеровской пипетки и промы- 45 вают ее ТБР. Образцы P ФНО- о и P ФНО- Р готовят на минимальной среде, модифицированной Дульбекко (ДМЕМ) с 5Х 3ТС, глютамином, меркаптоэтанолом, пенициллином и стрептомицином 50 (полная среда ДМЕМ). 0,5 мл образца пропускают через колонку в течение 15 мин, затем собирают и стерилизуют фильтрацией. Биологическую активность факторов определяют по лиэису клеток мьш;иной фибробластоидиой линии 1929 в присутствии актииомицина Д. Накануне теста клетки 1929 рассевают по 50 тыс,/лунку Оптическая плотность окрашенных интактных клеток 1290. Из данных табл.2, следует, что пропускание через колонку с монАТ 7С1 образца ФНО- сС, приводит к потере его цитотоксической активности, что подтверждает специфичность монАТ и возможность их применения для иммуносорбции. Пример 3. Опр.=деление проводят в соответствии с примером 1, но вместо культуральной среды штамма 7G1 в лунки с сорбированным ФНО вносят соответствуюшие разведения асцита 7С1 на ЗФР-БСА. Результаты показывают, что при разведении асцита 1:1000000 оптическая плотность в ИФА (А492х10 ) составляет 380 и, таким образом, титр асцита превышает 1: 1000000. Использование гибридомы 7G1 позволяет получать монАТ изотипа С2Ь,что создает преимущества по сравнению с монАТ иэотипа С! при очистке на аффинных колонках с протеином. А золотистого стафилококка, а также создает возможность экономии асцита при определении ФНО. Формула изобретения 1530638 Таблица 1 Культуральная среда штамма 7С! А492 х10 Антигены.м +А492 — оптическая плотность лунок при 492 нм. Таблица 2 Фактор некроза опухолей Рекомбинантный ФНО- Ф Рекомбинантный ФНО-(3 Составитель А.Маныкин Редактор Н.Гулько Техред M.дидык - Корректор N.Ïîùî Заказ 7863/27 Тираж 501 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 БСА ФНО- ФНО- 2563 131 До сорбции, А540 х 10 316 Кроличья антисыворотка 1:5000 А492 х10 291 2584 481 Сорбция монАТ шт амма 7 С 1, А540 х 10 447
