Способ получения штаммов бактерий еsснеriснiа coli и рsеudомоnаs рuтidа-продуцентов креатинамидиногидролазы

 

Изобретение касается генетической инженерии, а именно получения креатинамидоногидролаза в штаммах бактерий ESCHERICHIA COLI I PSEUDOMONAS PUTIDA. Целью изобретения является получение штаммов, конститутивно продуцирующих креатинамидиногидролазу. Выделяют ДНК из PSEUDOMONAS PUTIDA, расщепляют эндонуклеазой ECORI, фрагмент размером 5,8 кв обрабатывают эндонуклеазами ECORI и PYUII и получают фрагмент размером 2,2 кВ, который клонируют в расщепленный эндонуклеазой вектор, трансформируют в штамм E.COLI DSM 2102 и P.PUTIDA DSM 2106. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 С 12 N 15/00 9 78

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H flATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Г10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4002500/30-13 (22) 03.01.86 (31) Р 3500!84.4 (32) 04.01.85 (33) DE (46) 15.11.89. Бюл.№ 42 (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DE) (72) Гюнтер Шумахер, Петер Букель и Клаус Бокамп (ЭЕ) (53) 575.224.2.577.2(088 ° 8) (56) Archivesof ВioсЬев and Вiophys, 1977(1976), 508-515.

US 9 4420562, кл. С 12 N 9/78, 1983.

Ъ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ IIITAMMOB БАКТЕ

РИЙ ESCHERICHIA COLI И PSEUDOMONAS, Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения креатинамидиногидролазы в штаммах бак. терий Escherichia coli u Pseudomonas

putida.

Цель изобретения — получение штаммов, конститутивно продупирующих креатинамидиногидролазу.

Выделяют ДНК из Pseudomonas puti"

day расщепляют эндонуклеазой EcoRI с выделением фрагмента размером

5,8 кВ, обрабатывают его эндонуклеазами EcoRI u PvuII и получают фрагмент размером 2,2 кВ, который клонируют в расщепленный вектор, трансфорьыруют в соответствующий Е.coli u P.putida.

Пример. Выделяют хромосомную

ДНК Pseudomonas putida DSM 2106 после

PUTIDA — ПРОДУЦЕНТОВ КРЕАТИНА1ЯДИНО

ГИДРОЛАЗЫ (57) Изобретение касается генетической инженерии, а именно получения креатинамидиногидролазы в штаммах бактерий Escherichia. cali u Pseudomonas putida. Цель изобретения— получение штаммов, конститутивно продуцирующих креатинамидиногидролазу, Выделяют ДНК из Pseudomonas putida, расщепляют эндонуклеазой EcoRI> фрагмент размером 5,8 кВ обрабатывают эндонуклеазами EcoRI u PvuII и получают фрагмент размером 2,2 кВ, который клонируют в расщепленный эндонуклеазой вектор„ трансформируют в штамм E.coli DSM 2102 и P.putidà

DSM 2106. 2 табл. разрушения клеток, наматывания ДНК М > на стеклянную палочку после двух об- (Д работок фенолом и осаждения этанолом, (Я растворяют ее в концентрации 600 pr/мл.

10 ш г хромосомной ДНК обрабатывают 5 единицами EcoRI и анализируют степень переваривания в агарозном

С геле.

10 бактерий штамма E.coli ED DSM

2102 инкубируют в присутствии 5 10

В фагов Шарон 10 в течение 20 мин при 37 С и затем оставляют для роста до начала лизирования бактерий (у4 в 500 мл полной среды с последующим выделением фага.

10 рг Шарон 10 ДНК полностью расщепляют 1 мг EcoRI эндонуклеазы, разрезанную хромосомную ДНК Pseudo3 1523055

monas putida инкубируют с 3 г расщепленного эндонуклеазой EceRI ДНК фага Шарон 10 с 40 единицами фермента Т4 ДНК-лигазы. Упаковку связанных

ДНК-фрагментов головные и хвостовые протеины фага ф производят в пробирке. Около 0 5 ш г связанных ф и Pseudomonas ДНК инкубируют посредством

/ исходнои смеси,в упаковке в пробирке,10

"через 60 мин добавляют 0 5 мл ЯИ буферного раствора, 1/200 объема (2,5 рл) исходной смеси в упаковке инкубируют при помощи 200 л выдержанлого в течение ночи штамма Е.coll (в 10 молярном сульфате магния) .а

10 мин при 37 С. Суспензию бактерий смешивают затем с 3 мл LB-агарозы (0,8%) и выливают íà LB-пластины.

iia 1 р г введенной ДНК получают около

15 фаговых отверстий (тромбоцитов).

Для идентифицирования фагов, которые содержат кодирующий креатиназу. ген, применяют иммунотест с фермен.том. Индикаторная система состоит 25 из 6 мг/мл тетраметилбензидина, 20 мг/мл диоктилнатрийсульфосукцината и 0,01% Н 0 в 6% ной желатине.

На 1000 тромбоцитов. устанавливают два положительных сигнала.

Из пяти положительных в иммунотесте с ферментом тромбоцитов полу» чают препарат фагов -ДНК.Расщепление I пяти различных ДНК посредством

EcoRI пОЗВОлилО ВЫЯВить ДНК пОлосу 3 во всех пяти фагах ДНК 5,8 кВ.

Приблизительно 5 рr этого EcoRIфрагмента расщепляют при использовании PUUII эндонуклеазы и выделяют фрагмент размером 2,2 KB,Образующиеся 40 фрагменты ДНК разделяют в низкоплавком геле агарозы по их размеру и выделяют фрагмент EcoRI — PvuII

Выделение ДНК-фрагментов из низкоплавких гелей агарозы производят

45 вырезанием соответствующих полос, переводом в пробирку (трубочку

Эппендорфа) и смешиванием приблизительно с двухкратным объемом воды, затем инкубируют при 65 С до тех пор (от 5 до 10 мин), пока не расплавится агароза, пробу встряхивают в течение короткого времени и потом интенсивно встряхивают с половиной объема фенола (нейтрализованного

10 ммол ТРА"НС1 .с РН 7,5 и 1 мм ЕДТА,,TE). Фазы разделяют центрифугированием эа 10 мин при 15000 g и верхнюю водную фазу снова экстрагируют встря-, хиванием с фенолом. После центрифугирования в течение 10 мин при 15000 g верхнюю фазу дважды экстрагируют путем встряхивания с простым эфиром (по

1 мл), простой эфир Выпаривают при

65 С и ДНК осаждают при помощи 1/10 объема 3 N ацетата натрия с рН 7,2 и

2,5-кратного объема этанола при 20 С.

ДНК осаждают центрифугированием за

10 мин при 15000 g сушат в вакууме и вводят в 10 цл ТЕ.. Все описанные дальше выделения фрагментов производят аналогично.

Около 4 ш г pBR 322 ДНК расщепляют посредством EcoRI u PvuII и выделяют фрагмент размером 2,3 кВ. 0,2 pr этого pBR 322-фрагмента инкубируют в течение ночи в присутствии пяти единиц Т4 ДНК-лигазы и 0,5 p r EcoRI—

PvuII-фрагмента размером 2,2 кВ из описанных 71 -фагов. Полученную плаз миду называют рВТ-3-2, она кодирует

a E,coli биологически активную креатиназу.

Пример 2. Фрагмент ДНК, кодирующий креатиназу из плазмиды рВТ-32, обрабатывают нитроэогуанидином.

Выделяют плазмидную ДНК после лизирования клеток прн помощи метода CSCIэтилбромида. Клетки штамма E.coli

ED 8654 трансформируют при помощи плазмидной ДНК и помещают на пластинах полной среды (LB), содержащих 20 Pr/мл ампициллина. После инкубации в течение ночи при 37 С íà LB-пластины помещают нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу. После инкубации в течение 12-18 ч при 370С нитроцеллюлозный фильтр с колониями снимают и переводят в стеклян-. ную чашку Петри (ф 20 см), в которую был добавлен 1 мл смеси хлороформа с толуолом (1:1) . Инкубацию проводят за 20 мин при 37 С. Затем нитроцел люлозный фильтр накладывают на индикаторную агарозную пластину таким образом, чтобы возникал прямой контакт между клетками и индикаторной пласти»

Ной.

Цветная реак1ц1я происходит в зависимости от вримени и количества синтези . рованной в отдельных клонах креатина зы. Из описанной системы фильтрования выделяют клон ЕД с .плазмидой рВТ 2а-1, DSN 3143. Эта плазмида кодирует креа» тиназу, которая составляет около 50% растворенного протеина клеток, Как альтернативу к описанному прямому NC-мутагенезу увеличение уровня

5 1523055 б экспрессивности креатиназы можно дос- Упомянутая индикаторная агарозная тигнуть с помощью 1ас-промотора (по- пластина представляет тест-систему следний можно выделять из имеющихся для отбора активности, принцип котоI в продаже плазмид, например рцС- рой состоит в том, что креатин расщепплазмид). Для этого плазмиду

5 ляют ферментами креатинамидиногидроларВт-3-2 обрабатывают EcoRI-эндонук-. зы и сарказиноксилазы на образования леазой, обрабатывают эндонуклеазой Н О чеоез пероксидазу в 1/2 О и Н О а

Bal 31 таким образом, что удаляют и осуществляет реакцию кислорода с около 10-100 вР с каждои стоРоны, 10 системои цветного индикатора„ наприЗатем lас-промотор при помощи фермен- мер, из 4-аминоантипирина (4ААН) и та Т4-лигазы, связывающего концы, 11-этил-М-(сульфоэтил)-3-метиланилина, вводЯт в УкоРоченнУю плазмидУ ВТ 3-2. соли FST. Образуется голубовато-фиолеЭту ДНК мУтагенизиРУют с нитРозогУани- товое окрашивание, которое при избытке дином, после этого применяют для 15 Ферментов сарказиноксилазы и перокситрансформации штамма ED и клоны ис- дазы представляет степень синтезиро-. пытывают на высокую экспрессивность ванной в колониях креатинамидиногидрогена. лазы.

Тест-принцип: креатинамидиноКреатии ь Н О тидрслааа сарксаии ь исиеаииа

Sarc — CD

Саркозин + О + Н О глицин + формальдегид + Н О

P0D

НсОе + 4 AAP + Е$Т краситель + 2НеО

Состав системы фильтрующей активности креатинамидиногидролазы показан в табл. 1, ЗО

Указанные в пунктах 1.-7 реактивы растворяют и смешивают с одинаковым объемом низкоплавкой агарозы (27), 6 мл выливают в чашку Петри, пластины

Ъ можно хранить около 2 недель при 4 С в. темноте.

Пример 3. Для клонирования и обеспечения экспрессивности клонированной креатинамидиногидролазы в Pseudomonas putida применяют плазмиду RSF 1010. RSF 1010 линеаризируют посредством PstII и из плазмиды рАСУС

177 после НАЕ11 — расщепления выделяют

1,4 кВ-фрагмент, 0,2 рг RSF 1010 ДНК связывают с 1 рг Нае II-фрагмента при использ овании Т4-лигазы, получающаяся плазмида представляет собой рВТ

306,1 RSF 1010 и производные этой плазмиды отличаются широким диапазоном50 хозяина и пригодны, например, для

Рвеыйотаопайеп и Е.coli. Плазмиду рВТ

2а-1 расщепляют посредством PvuI u

IPvuII выделяют 2,8 кВ-фрагмент.рВТ 306,1 плазмиду расщепляют посредством PvuI u SmaI и выделяют фрагмент размером 10 кВ. 0,5 р r векторной

ДНК связывают с 0,5 рг Pvu I-PvuIIфрагмента. Е.coli ED трансформируют и идентифицируют кодирующие креатинаэу клоны при помощи отбора активности на пластинах. Из одного из положительных клонов получают по методу с СЯСТ-этилбромидом плазмидную ДНК. Плаэмида имеет название рВТ 306,16, DSN 314/ P

Трансформируют.плазмидную ДНК в Pseudomonas putida 2440.

При помощи фильтрования с отбором активности на пластинах идентифицируют положительные клоны. Это возможно у Pseudomonas putida 2440, хотя этот штамм содержит хромосомнокодированную креатинамидиногидролазу, так как экспрессивность кодированной плазмидной креатинамидиногидролазы проявляется структурно ° Этот отличительный признак позволяет проводить различие между кодированной хромосомой и кодироранной плазмидной креатинамидиногидролазой.

Пример 4. Определение актив-. ности креатинамидиногидролазы производят обнаружением образованных в результате реакций с уреазой ионов аммония с тест-комбинацией "мочевина".

Дикий тип Pseudomonas putida

2440 для определения активности креатинамидиногидролазы инкубируют при

30 С в течение ночи в В-среде (5 мл)

) которая содержит 17. креатина.

1523055

Клетки собирают центрифугированием и промывают один раз в 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 7,5.

Клетки в первоначальном объеме вводят в фосфатный буферный раствор (50 мМ с рН 7,5) и растворяют обработкой ультразвуком (4y30 с).

Выращивание и растворение клеток, которые содержат плазмиду, кодирующую 10 креатинамидиногидролазу, проводят опи санным способом, с тем исключением, что среда не содержит креатина для индукции и что отбирают с добавкой ампициллина (20 г/мл для плазмиды рВТ 2а-1) или стрептомицина (20 рг/мл для плазмиды рВТ 306.16), Рост культур происходит для Pseudomonas putida при 30 С, для Е.coli — при 37 С.

Данные показывают, что в результа 20 те. клонирования креатинамидиногидролазы в E. coli бактерии получают новое свойство синтезировать креатинамидиногидролазу и эта экспрессивность в противоположность исходному штамму

Рзеийотопав рШida проявляется структурно как для Е.coli, так и для Pseudomonas putida. Благодаря мутагенезу

ДНК, кодирующих креатинамидиногидролазу, можно достигнуть особенно высо- 30 кой экспрессивности.

В Е.coli ЕД/рВТ 2А»1 DSM 3143 активность составляет 500 ед./r биомассы (влажной), удельная активность

4,5 ед./мг протеина, Так как удельная активность высокоочищенного протеина составляет 9 ед./мг, это означает, что креатинамидиногидролаэа в Е.coli составляет 50 . растворимого протеина.

Анализ сырого экстракта s DSS-геле показывает, что креатинамидиногидрола40 за представляет основную полосу фракции растворимого протеина.

Пример 5. Для культивирования45 в Йерментере применяют три ра личных .системы хозяина Е.coli а именно

Е.со11 И 3350, Е.со11 ЕД 8654 и Е°, со11

CHI. Плазмиду рВТ 2а-1 трансформируют в соответствующие компетентные клетки.

Отдельные колонии культуры выращивают в DYT-среде, которая содержит 20 г/мл ампициллина, в течение ночи при 37 С.

О

Ферментационную среду (DYT) засевают предварительной культурой (инокулят

1/) и без отбора на содержание плазми с

55 о ды оставляют на 20-30 ч при 3? С для. роста. Активность креатинамидиногидролазы после 25 ч инкубирования составляет около 600 ед/г сырой массы или 4,5 ед./мг протеина.

Плазмиду рВТ 306.16 трансформируют в клетки Pseudomonas putida штамма

2440, причем получают Р. putida DSM

И3147.

После очистки отдельных колоний инкубируют культуру в DYT-среде, которая содержит 200 рг/мл стрептомицина при 30 С в течение ночи. Ферментационную среду (ДУТ) засевают (инокулят 1 ) и оставляют культуру для роста на 20-30 ч при 30 С, Активчость после 25 ч составляет около

220 ед./r сырой массы, активность

1,8 ед./мг протеина.

Формула и з обретения

Способ получения штаммов бактерий

Escherichia co1i u Pseudomonas putida — продуцентов креатинамидиногидролазы, заключающийся в том, что хромосомную ДНК из Pseudomonas putida

DSN 2106 и ДНК фага Иарон 10 обрабатывают эндонуклеазой Есо. RI, лигируют полученные фрагменты, упаковывают гибридные ДНК в присутствии 2-х протеинов оболочки фага, трасдуцируют полу ченными гибридными фагами клетки

Е.coli DSN 2102„ которые предварительно обрабатывают в течение ночи

0,2/-ным раствором мальтозы и раство» ряют в 0,1 М/л MgSO, далее идентифицируют фаги, экспрессирующие креатинамидиногидролазу с помощью индикаторной системы, содержащей 6 мг/мл тетраметилбензидина, 20 мг/мл диоктилнатрийсукцината и 0,01% Н О в б -ной желатине, выделяют фаги, дающие положительную реакцию, ДНК этих фагов об-( рабатывают зндонуклеазой Есо.RI c последующим выделением фрагмента размером 5,8 кВ, которые обрабатывают эндонуклеазой PvuII, выделяют Есо.RIPvuII — фрагмент размером 2,2 кВ, который лигируют с расщепленным .

Есо.RI u PvuII вектором pBR 322, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют клетки бактерий Е.cali Э$И

2102, отбирают клетки, конститутивно продуцирующие креатиназу, полученные клетки обрабатывают 25 мг/мл нитрозогуанидином, выделяют плазмидную ДНК, . которой трансформируют клетки Е.со"

li DSM 2102 отбирают бактерии, содержащие плазмиду рВТ 2а-1, полученной плазмидной ДНК трансформируют

Е.coli DSM 2102 и обрабатывают ее

1523055

10 фрагментом 1,4 кВ HaeII плазмиды рАСУС177, полученными рекомбинантнымн

ДНК трансформируют клетки P.putida

DSM 2440 и выделяют клоны, констнтутивно продуцирующие креатинамидиногидролазу. эндонуклеазами Pvul и PvuII, выделяют фрагмент размером 2,8 кВ, который лигируют с фрагментом РслзТ вЂ” SmaI размером 10 кВ вектора рВТ 306,1, полученного в результате обработки плазмиды рЯЕ 1010 и лигирования с

Таблица .1

Но

Состав

Содержание Концентрация мер

Конечная

Таблица,2

Креатинамидиногидролаза в Pseudomonas

putida и Е.Coli

Нтамм/плазмид

АктивВыращивание ность ед/л креатин креатин

2

250

Составитель Н, Кузенкова

Техред Л.Сердюкова Корректор О.Кравцова, Редактор M.Ïåòðoâà

Заказ 6985/59 Тираж 501 Подписное

ВНИИПЙ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, .Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Цроизводственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

2

4

6

Креатин

NaNO>

Тгз.с HCI с рН 7,8

Саркоэиноксилаза

Пероксидаза

4 ш AAH .

EST

Pseudomonas putida 2440

То же

Pseudomonas putida рВТ 306.16

Е. coli ED

Е. coli ED/рВТ 3-2

Е.coli ED/ðÂÒ 2а-1

10 мм

0,5 мм

20 мм

5 ед./мл

2,5 ед./ил.

0,25 мг/мл

1,5 мг/мл

2800

То же ((tf ! (ff креатин креатин креатин креатин