Способ отбора токсичных химических соединений липофильной природы

 

Изобретение относится к медицине, конкретно токсикологии, и может быть использовано для отбора токсичных химических соединений липофильной природы, оказывающих влияние на организм человека. Цель изобретения состоит в повышении точности прогнозирования токсичности химических соединений, имеющих липофильную природу. Сущность предлагаемого способа заключается в том, что изучаемое химическое соединение в различных концентрациях преинкубируют с изолированными митохондриями из печени крысы в течение 1 ч, затем измеряют скорость поглощения кислорода этими препаратами митохондрий в стандартной инкубационной смеси, определяют концентрацию химического соединения, вызывающую 50%-ную степень угнетения дыхания митохондрий, и рассчитывают токсикометрические параметры. Описанный способ дает возможность быстро, с удовлетворительной точностью и экономично прогнозировать токсическое действие больших групп химических соединений липофильной природы. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) («1) 4 С 01 И 33/48

;и ),.ч «д .. (ма М

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1g 1/А = В 1g 1/СБо D, . ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4382854/28-14 (22) 22.02.88 (46) 30,12.89. Бюл, Ф 48 (71) Донецкий медицинский институт им. М,Горького (72) Н.В.Животникова и Л.С.Ягужинский (53) 621.0!5(088.8) (56) Экспрессное определение параметров токсикометрии новых химических агентов на изолированных митохондриях печени. Методическая рекомендация.

M.: Минздрав РСФСР, 1977, с. 35. (54) СПОСОБ ОТБОРА ТОКСИЧНЫХ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ЛИПОФИЛЬНОЙ ПРИРОДЫ (57) Изобретение относится к медицине, конкретно токсикологии и может быть использовано для отбора токсичных химических соединений липофильной природы, оказывающих влияние на орга низм человека. Цель изобретения соИзобретение относится к области медицины, а именно к токсикологии, и может быть использовано при исследовании токсичности соединений, оказы-.

Ъ вающих влияние на организм человека.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Цель достигается тем, что после выделения митохондрий из печени крысы методом дифференциального центрифугирования отбирают несколько порций изолированных митохондрий, в которые за исключением контрольной вносят изучаемое соединение в разных концентрациях; проводят преинкубацию

2 стоит в повышении точности прогнозирования токсичности химических соединений, имеющих липофильную природу.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что изучаемое химическое соединение в различных концентрациях преинкубируют с изолированными митохондриями из печени крысы в течение 1 ч, затем измеряют скорость поглощения кислорода этими препаратами митохондрий в стандартной инкубационной смеси, определяют концентрацию химического соединения, вызывающую

50Х-ную степень угнетения дыхания митохондрий, и рассчитывают токсикометрические параметры. Описанный способ дает воэможность быстро, с удовлетворительной точностью и экономично прогнозировать токсическое действие больших групп химических соединений липофильной природы. 3 табл ° данного соединения с митохондриями в течение 1 ч, после чего митохондриальные препараты помещают в стандартную водную инкубационную среду и измеряют полярографическим методом скорость потребления кислорода при дыхании, сопряженном с фосфорилированием; определяют концентрацию изучаемого соединения, преинкубация которого с митохондриями вызывает подавление потребления кислорода на 50Х, .и производят расчет токсикометрических параметров по формуле

1532871 где А — прогнозируемая среднесмертельная доза (ЛЭ, ) или прогноэи руемая величина ориентировочного безопасного уровня воэ5 действия соединения (ОБУВ) (в определенных условиях ей соответствует величина предельно допустимой:концентрации соединения — ПДК); l0

ЫС

С вЂ” молярная концентрация иэучае15о. мого соединения, преинкубация которого с изолированными митохондриями вызывает угнетение поглощения ими кислорода на 507..

В и D — - коэффициенты, получаемые методом регрессивного анализа.

Пример 1. Методом дифференциального центрифугирования выделяют 20 митохондрии из печени интактной кры1 о

ы при 0-4 С. С полученными изолированными митохондриями работают в течение 3,5-4 ч. Полярографиыеским ме 1 одом определяют скорость потребления 25 кислорода митохондриями в стандартной инкубационной среде в режиме дыхания, сопряженного с окислительным осфорилированием. Эта величина в данном примере равна 42,0 нМ кислорода 30 (мин мг белка), ее принимают эа 1007.

Ns общего количества изолированных

Митохондрий отбирают несколько порций. В каждую из них эа исключением контрольной добавляют изучаемое липо- 35 фильное соединение, например бензол.

Вносят разные количества бензола, созфают следующие концентрации: 1 10

$ 10-4 1 ..10 4 5 10 5 1 10 5 10 б (М) ° Проводят предварительную инкуба- 40 цию в течение 60 мин при 0-4 С. После преинкубации митохондриальные препараты помещают в стандартную водную инкубационную среду. Полярографическим методом определяют скорость потребления кислорода опытными и контрольным митохондриальными препаратами (см, табл ° 1 ° ).

После преинкубации скорость потреб-50 пения кислорода митохондриальным препаратом без добавок бензола равна л2,0 нМ О /мин мг белка, т.е. тождественна изначальной. Скорость потребления кислорода митохондриальными препаратами после преинкубации с бензолом уменьшается с увеличением концентрации изучаемого соединения, преинкубированного с митохондриями. Onределяют концентрацию бенэола, которая вызывает 507-ное угнетение скорости потребления кислорода митохондриальным препаратом после преинкубации.

Эта величина равна 1,12 ° 10 М (табл.l)

Производят расчет токсикометрических параметров.

Прогнозирование среднесмертельной дозы осуществляют по соотношению

1g 1/ЛД5 = 0,40 1g 1/С вЂ” 0,28.

Молярная концентрация бенэола, вызвавшая 507-ное угнетение дыхания митохондриального препарата после

-а предварительной инкубации, 1,12 IO M.

С, „ = 1 12 10 ; 1/I 12 10 =8,89 10

1g 8,89 10 =4,95;, 0,4 4,95-0,28=1,70;

1g 1/ЛДво =1 70; 1/ЛД6о=50,07; ЛДко=*

2,00 10 (г/M кг). Учитывая молекулярную массу бензола, равную 78,12 г, величина ЛД „2,00 ° 10 78, 12=1, 56 r/êã, Экспериментально определенная величина ЛД О(5,6 г/кг (по прототипу

0,21 r/êã), а прогнозируемая ЛД по данному способу 1,56 F/кг. Таким образом, имеет место удовлетворительное совпадение прогноэируемой и экспериментально определенной величин среднесмертельной дозы липофильного соединения — бенэола, так как в настоящее. время для токсикометрических параметров считается допустимым и удовлетворительным расхождение величин их, определенных разными способами, в пределах одного порядка, т.е. не более, чем в 10 раз.

Пример 2. Прогнозирование величины ориентировочного безопасного уровня воздействия соединений или соответствующей ей в определенных условиях величины предельно допустимой концентрации соединения (соответственно ОБУВ и ЦДК) осуществили по соотношению 1g 1/ОБУВ. = 0 59 1g 1/С +

+ 4,65, где ОБУ — величина ориентировочного безопасного уровня воздейinc ствия, мг/м ; С .5 — молярная концентрация изучаемого соединения, преинкубация которого с изолированными ми- тохондриями вызвала угнетение их дыхания на 507.

Для липофильного соединения монобензилметилбензола С;д оказалась равной 5,10 10 М. С ."с =5,1 ° 10

1/5, I 10 =1,96 ° 10, 1g 1,96 ° 10

5, 29. 0,59 5,29+4,65=7,77;

1g 1/ОБУВ =7 77 1/ОБУВ=5,92 10

Э

ОБУВ = 1,69 ° 19 г/М л. Учитывая моле153287 кулярную массу монобензилметилбензола, равную 182,26 г, величина ОБУВ.—

1,69 ° 10 182,26 = 3,09 10 г/л.

Или в принятой в токсикологии системе единиц 3,09 10 10 = 3,09 мг/м

Величина ОБУВ монобегзилметилбензола, рассчитанная на осноье экспериментально определенных токсикометрических параметров 1,0 мг/м . Таким обра- 10 зом, имеет место удовлетворительное совпадение прогнозируемой и экспериментально определеннс и величины ОБУВ монобензилметилбенэола.

В табл.2 представлены токсикометрические параметры, определенные для ряда химических соединений.

Формула изобретения

В табл.3 представлена динамика изменения скорости (V) потребления кис- 20 лорода митохондриями в зависимости от длительности преинкубации их с тремя типами химических соединен-. й. 2,4-Динитрооксибензол, карбоксибензол (бенэойная кислота) и бензол являются 25 представителями, соответственно гидрофильных, полярных липофильных и неполярных липофильных соединений. Как

Таблица 1

Митохондриальные препараты Параметры дыхания митохондрий онтрольый

Опытные с концентрацией бензола, М

5 10 I ° 10

1.10 5 10 1 10 5-10

10,2 12,5 16,3 19,0 21,0 23,9

42,0

l0O,0 24,3 29,8 38,8 45,2 50,0 56,9

75э7 70в2 61ю2 54.8 50 ° 0 43,1

Таблица 2

Среднесмертельная доза ОБУВ или ПДК

Изучаемое соединение

ЭкспериментальПрогнозируемая

Эксперименталь

Прогноэируемая по дан- по про ному тотипу способу по дан- по про но опреному тотипу деленная способу но определенная

Бензол 1,56 5,61 1,72 1,20 5 0

Монобензилметилбензол 2,66 5,20 3,09 0,49 1,0

0,21

0,15

Скорость потребления кислорода, нМ О /мин мг белка

Скорость потребления кислорода, Х к контролю

Степень угнетения скорости потребления кислорода, Х к контролю

1 6 с видно из табл.3, для выявления воздействия ка скорость потребления митохондриями кислорода неполярных липофильных соединений длительность пре инкубации в течение 60 мин достаточна, для выявления воздействия полярных липофильных и гидрофильных соединений — более чем достаточна.

Способ отбора токсичных химических соединений липофильной природы путем определения степени угнетения ими дыхания митохондрий печени крысы, включающий инкубацию митохондрий в присутствии изучаемого соединения, определение концентрации соединения, вызывающей 50Х-ное .угнетение дыхания, и последующий расчет токсикометрических параметров, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения точности, перед определением концентрации вещества, вызывающего 50Хное угнетение дыхания, проводят преинкубацию митохондрий с исследуемым веществом в течение 1 ч.

153287) Продолжение табл,2

Изучаемое соединение

Среднесмертельная доза

ОБУВ или ПДК

Прогнозируемая

Прогноэируемая

Эксперименталь-1 по данному способу по прототипу но определенная по дан- по про ному тотипу способу

4,27 3,35

0,08 0,08 .0,05

Изоамилфталимид

2!,4-Динитрофенол

2l,6-Дитретбутил-4-мет илфенол

Диметилацеталь метоксиакролеина

3,50

0,17

3,50.

0,22

0,59

0,04

2,45 1,27 0,04

0,03

1,67

0,86 9,76 1,0

1,1О

l,70

1,01

П р и м е ч а н и. е: Для ряда соединений, в частности изоамилфталимида и

2,6-дитретбутил-4-метилфенола (ионола), отсутствуют экспериментально определенные величины ОБУЗ или ПДК.

Таблица 3

Длительность преинкубации, мин

Показатели

2 3 15 30 60 120 180

2,4-динитрооксибенэол

21 21 21 21

21 21 21

25 21, 59,5 50

35 29

83,3 69

50 50 50 50 50 50 50

Карбоксибензол (бензойная кислота)

28 24 21,5 21 21 21 21

50 50 50.

66,7 57,1. 51,2 50 чальной

Бензол

38 36,5

39

32 24

21 .21 21

95,2 92, 9 90,5 86,9

76,2 57,1 50 50 50

П р и м е ч а н и е: Первоначальная величина скорости потребления кислорода равна. для всех препаратов митохондрий 42 нМ О /мин мг белка. Концентрации соединений: 2,4-динитрооксибензол

1 10 М; бензойной к-ты 2,5 10 М; бензола 6,7 10 М.

Составитель И.Дробинская

Техред Л.Олийнык Корректор Л.Бескид

Редактор О.Спесивых

Заказ 8094/5) Тираж 789

Подписное

ЗНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Yæroðîä, ул. Гагарина,101

Ч, нМ О /мин мг белка

V, Ж от первоначальной

Ч нМ О /мин ° мг белка

V, . от первонаV нМ О /мин мг белка

V X от первоначальной

Эксперименталь— но определенная