Способ определения антиинтерфероновой активности микроорганизмов

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при определении биологической активности микроорганизмов. Исследуемую культуру высевают на питательную среду, в которую добавляют лейкоцитарный человеческий интерферон в разведении 1/60-1/40. Посев осуществляют локально по поверхности среды. После инкубирования культуру инактивируют и наслаивают питательную среду, в которой суспендируют тест-культуру CORYNEBACTERIUM XEROSIS ГИСК N181. После повторной инкубации посевов изучают локализацию колоний тест-культуры. Если исследуемая культура обладает антиинтерфероновой активностью, то вокруг колоний вырастают колонии тест-культуры.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ

ПРИ П НТ СССР

1 (21) 4439476/30-13 (22) 28.04.88 (46) 15.05.90. Бюл, Я- 18 (71) Оренбургский государственный медицинский институт (72) О.В. Бухарин и В.lo. Соколов (53) 576.8.093.1 (088.8) (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИИНТЕРФЕРОНОВОЙ AKTHBHOCTH МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при определении биологической активности микроорганизмов.

Исследуемую культуру высевают на пиИзобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при определении биологической активности микроорганизмов, Для осуществления способа в качестве тест-культуры используют штамм

Corynebacterium xегоsis 4060, который депонирован под номером ГИСК Р 181 и характеризуется следующими признаками °

Культурально-морфологические признаки.

Величина клеток суточной культуры на обычном мясопептонном агаре 1,52,0 0,3-0,5 мк. Грамположительны, располагаются при росте. частоколом и под углом друг к другу. Тело палочки окрашивается неравномерно, по концам располагаются круглые зерна, окрашиваемые более интенсивно. Хорошо растет без добавления сыворотки на ! простых питательных средах. На мясо„„Я0„„3 564191 А 1 (5l)5 С 12 Q 1/02 (С 12 Q 1/02, С 12 К 1:15) тательную среду, в которую добавляют лейкоцитарный человеческий интерферон в разведении 1/60-1/40. Посев осуществляют локально на поверхности среды. После инкубирования культуру инактивируют и наслаивают питательную среду, в которой суспендиру.ют тест-культуру Corynebacterium

xегоsis ГИСК В 181. После повторной инкубации посевов изучают локализацию колоний тест-культуры. Если исследуемая культура обладает антиинтерфероновой активностью, то вокруг колоний вырастают колонии тест-культуры. пептонном бульоне растет в виде равномерной взвеси. На мясопептонном агаре образует гладкие ровные колонии диаметром 1 мм.

Физиолого-биохимические признаки.

Развивается как в аэробных, так и в анаэробных условиях, оптимум роста

22-37 С.

Расщепляют сахарозу, мальтозу, левулезу, глюкозу, галактозу, декстран, ,мочевину, не ферментирует крахмал, гликоген.

На кровяном агаре зоны гемолиза не образует.

Чувствителен к эритромицину, тетрациклину, пенициллину.

Чувствителен к препарату человеческого лейкоцитарного интерферона:

МПК-l/512, МБК-1/64 разведения препарата человеческого лейкоцитарного интерферона.

1564191

Способ осуществляют следующим образом. ,К 1,5 -ному питательному агару до бавляют препарат человеческого лейкоцитарного интерферона в разведении

1/60-1/40 и разливают в чашки Петри.

После застывания среды и ее подсушивания на поверхность наносят петлей в виде отдельных "пятачков" суточную агаровую культуру исследуемых штаммов. Чашки инкубируют сутки при 37 С, после чего выросшие колонии бактерий убивают парами хлороформа в течение

20-25 мин, а затем на "пятачки" куль- 1 тур разливают слой питательного агара (3-4 мл) с 0,2 мл 1 млн. взвеси суточной агаровой культуры Corynebacterium xегоsis, 4060. Затем повторно инкубируют чашки 24 ч при 37 С.

Учет опыта проводится по наличию роста С. xегоsis. Тест-культура вырастает вокруг колоний тех ттаммов, которые нейтрализовали внесенный в питательную среду человеческий лейкоцитар25 ный интерферон.

Способ иллюстрируется следующими примерами„

Пример 1. Оценивают нирулентность изогенных вариантов бактерий шигелл Флекснера с наличием и отсутствием айтиинтерфероновой активности.

С этой целью инбредных мьппей заражают внутрибрюшинно в дозе 5*-10 исследуеI мых бактерий на мьппь. В результате в опыте со штаммом, у которого определяется айтиинтерферононая активность, иэ десяти мышей погибает на третьи сутки 5 мышей, на пятые сутки — еще

4 мыши. Летальность составляет 90X.. 40

В опыте со штаммом, у которого антиинтерферононая активность не определяется, погибает 1 мышь на пятые сутки эксперимента. Летальность составляет 10Х, 45

Таким образом, наличие антиинтерфероновой активности у бактерий отражает их нирулентные свойства.

Пример 2. На иэогенных вариантах шигелл Флекснера с наличием и отсутствием антиинтерферононой активности определяют персистирующие свойства бактерий.

С этой целью инбредйых мышей по

25 шт. н каждой группе внутрибрюшинно

5S заражают исследуемыми штаммами микроорганизмов н дозе 5 "10 микробных

C клеток на мьппь. Начиная с четвертого дня мышей забивают по 2 шт. из каждой партии через каждые три дня и делают нысевы из печени и селезенки на бактоагар Плоскирева с подсчетом выросших колоний.

Результаты опыта показывают,.что штамм, обладающий антиинтерфероновой активностью, задерживается в организме мышей в два раза дольше, чем изогенный вариант этого штамма, не обладающий данным свойством, Пример 3. У пациента И. определена бактериурия 10 тыс. КОЕ (штамм Е.coli;). Проведенное исследование на наличие у ныделенного штамма антиинтерфероновой активности дало отрицательный результат. Полное клиническое обследование и дальнейшее наблюдение позволили сделать заключение, что пациент здоров, Наличие бактериурии в данном случае расценено как контаминация мочи

"транзиторной" (непатогенной) микрофлорой без антиинтерферойовой активности.

Hp и м е р 4. Больная К. Бактериурия 10 тыс. КОЕ (возбудитель

Е. coli). У возбудителя выявлена антиинтерферононая активность. На основании клинических признаков и бактериологического исследования поставлен диагноз: латентный пиелонефрит.

На четвертый день пребывания н стационаре присоединилась вторичная вирусная инфекция с клиникой острого бронхита, протекавшего длительно, н тяжелой форме. На протяжении всего периода лечения сохранялась стабильная бактериурия: 10-20 тыс.КОЕ (возбудитель Е. cali) с антиинтерферононой активностью, Воэникнонение ослож,нений в данном случае расценено как случай возникшего иммунодефицита на фоне латентного пиелонефрита, вызванного возбудителем с наличием антипнтерферононой активности.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет выявить и изучить свойство бактерий, по которому возможно проводить идентификацию патогенных бактерий, оценку вирулейтных и персистентных свойств бактерий, возникновение и прогнозирование осложнений вирусной (бактериальной) природы йа фоне разнившегося иммунодефицитного состояния (по интерферону) макроорганиэма.

10 .

Составитель Г. Смирнова

Редактор А. Маковская Техред Л.ОЛийнык

Корректор Э, Лончакова

Заказ 1139 Тираж 483 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,.Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.yæãoðoä, ул. Гагарина, 101

5 I564I9

Формула изобретенияСпособ определения антиинтерферонорой активности микроорганизмов, заключающийся в том, что исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на питательной среде в присутствии человеческого лейкоцитарного интерферона в разведении l/60-1/40, 1 6 выросшую культуру инактинируют, на посев наслаивают второй слой питательной среды, содержащей взвесь тесткультуры Corynebacterium xeric!sis

ГИСК В 18), посев инкубируют и определяют антиинтерфероновую активность микроорганизмов по наличию роста тест-культуры вокруг колоний испытуемой культуры.