Способ удаления т-лимфоцитов из суспензии мононуклеарных клеток человека

 

Изобретение относится к иммунологии. Целью изобретения является обеспечение точности удаления Т-лимфоцитов из суспензии мононуклеарных клеток человека. Цель достигается путем добавления интактных эритроцитов барана к суспензии мононуклеаров для образования розеток, последующего осаждения розеток на градиенте плотности Т-лимфоцитов в растворе верографин фиколл, причем дополнительно к интактным эритроцитам барана добавляют 22 27% эритроцитов барана, нагруженных Е-рецептором. Способ по изобретению позволяет получить более чистую популяцию "неТ"-клеток, содержащую в семь раз меньшее количество малодифференцированных Т-лимфоцитов по сравнению со способом-прототипом.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения материалов для иммунологических испытаний с использованием красных кровяных телец. Цель изобретения обеспечение полноты удаления Т-лимфоцитов за счет удаления предшественников Т-лимфоцитов. Сущность изобретения заключается в том, что очищенную от Т-лимфоцитов популяцию получают удалением розеток, образовавшихся с эритроцитами барана, в которые добавлено 22-27% эритроцитов барана, нагруженных Е-рецептором, в связи с чем в розеткообразовании участвуют не только зрелые, несущие Е-рецептор Т-клетки, но и их предшественники, которые не несут Е-рецептор, но имеют структуру для его реабсорбции; розетки удаляют в растворе верографин фиколл. П р и м е р. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяют из периферической крови, стабилизированной гепарином (250 ед/мл), методом градиентного центрифугирования в растворе верографин фиколл. Получение Е-рецептора проводят путем инкубации МНК в концентрации 2,5 х 10⁶ кл./мл на водяной бане при 45^оС в течение 30 мин, добавления равного объема среды 199 (подогретой до 45^оС) и инкубации еще в течение 30 мин при 45^оС. Затем клетки осаждают при 400g 10 мин, надосадок замораживают, используя по мере необходимости в качестве источника Е-рецептора. Розеткообразование: к 0,5 мл МНК (10 х 10⁶ кл./мл) добавляют 0,15 мл 10% -ной взвеси ЭБ, 0,1 мл 5%-ной взвеси ЭБ-Ер и 0,25 мл 2%-ного раствора желатина в среде 199. Смесь клеток перемешивают, осаждают при 200 g 10 мин и наблюдают 40 мин при комнатной температуре. Получение ЭБ-Ер: кровь барана трижды отмывают средой 199 и готовят 10% -ную взвесь. Часть взвеси инкубируют с равным объемом Е-рецепторсодержащего надосадка клеток при комнатной температуре в течение 1 ч. Выделение "не Т"-клеток: после инкубации розеток удаляют 0,8 мл надосадочной жидкости, осадок суспендируют осторожным покачиванием пробирок, добавляют 0,8 мл надосадка, перемешивают и медленно наслаивают на 3 мл раствора верографин фиколл (содержащего 0,25% желатина). После центрифугирования (10 мин, 1000 g, при комнатной температуре) с поверхности раствора собирают клетки, которые трижды отмывают средой 199 и суспендируют для подсчета в 1 мл среды. Предлагаемый способ позволяет получить более чистую популяцию "не Т"-клеток, содержащую в семь раз меньшее количество малодифференцированных Т-лимфоцитов по сравнению со способом-прототипом. Кроме того, в два раза уменьшается и количество зрелых, несущих Е-рецептор Т-лимфоцитов.

Формула изобретения

СПОСОБ УДАЛЕНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ ИЗ СУСПЕНЗИИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, включающий добавление интактных эритроцитов барана к суспензии мононуклеарных клеток для образования розеток, последующее осаждение розеток на градиенте плотности Т-лимфоцитов в растворе верографин-фиколл, отличающийся тем, что, с целью обеспечения полноты удаления Т-лимфоцитов за счет удаления предшественников Т-лимфоцитов, дополнительно к интактным эритроцитам барана добавляют 22-27% эритроцитов барана, нагруженных Е-рецептором.