Способ приготовления эритроцитарного диагностикума для индикации лекарственной аллергии к антибиотикам

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунохимии. Цель изобретения - увеличение срока хранения стабильного стандартного эритроцитарного диагностикума для индикации лекарственной аллергии к антибиотикам. Для этого эритроциты человека 0/1/Rh-/ - группы или быка обрабатывают 5% - ным раствором ацетатальдегида при 35 - 37^oС в течение 24 - 36 ч и сенсибилизирует антиобиотиками, используя 0,5% - ную суспензию эритроцитов и антибиотики в раабочей дозе при объемном соотношении 1:1. 5 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии. Цель изобретения увеличение срока хранения стабильного, стандартного эритроцитарного диагностикума для индикации лекарственной аллергии к антибиотикам. Эритроциты, к которым лимфоциты человека не имеют рецепторов (человека 0/1/Rh/-/-группы, быка) обрабатывают 5%-ным раствором ацетатальдегида при 35-37^оС в течение 24-36 ч, сенсибилизируют различными антибиотиками в рабочем разведении, разливают в стерильные ампулы, запаивают, хранят при 2-4^оС. Способ осуществляется следующим образом. Приготовление универсального эритроцитарного диагностикума проводится в несколько этапов. 1. Эритроциты, к которым у лимфоцитов человека нет рецепторов (0/1/Rh/-/-группы крови человека или быка) стабилизируют ацетатальдегидом. 1.1. Свежеотобранные эритроциты трижды отмывают 0,85%-ным раствором NaCl. 1.2. Готовят 18% -ную взвесь отмытых эритроцитов в 0,85%-ном растворе NaCl. 1.3. Готовят 5% -ный раствор ацетатальдегида на 0,85% раствора NaCl, доводят рН до 7,0-7,2 с помощью 1 н раствора NaOH. 1.4. Эритроциты и ацетатальдегид смешивают в равных объемах (по 100 мл 1: 1) и выдерживают 24-36 ч в термостате при 37^оС при периодическом помешивании. 1.5. По окончании консервации эритроциты трижды отмывают 0,85%-ным раствором NaCl в течение 3 мин с центрифугированием при 3 тыс.об/мин. 1.6. Отмытые эритроциты суспендируют в 0,85%-ном растворе NaCl до получения 0,5% концентрации. II. Сенсибилизация эритроцитов лекарственными веществами антибиотиками и приготовление собственно диагностикума. 2.1. Раздельно сенсибилизируют подготовленные эритроциты разными антибиотиками, взятыми в рабочей дозе: пенициллин 1000 Ед/мл, эритромицин 75 мг/мл. Для этого эритроциты и антибиотики смешивают в соотношении 1:1, обеспечивают тесный контакт между ними путем тщательного встряхивания и выдерживают в течение 30 мин в условиях термостата при +37^оС. 2.2. Сенсибилизированные эритроциты тщательно отмывают физиологическим раствором с попеременным центрифугированием (2-3 раза). 2.3. Отмытый эритроцитарный диагностикум суспендируют в физиологическом растворе хлорида натрия до получения 0,5% концентрации. 2.4. Разливают готовые диагностикумы в стерильные ампулы, последние запаивают и хранят при температуре холодильника 2-4^оС. III. Постановка опыта по определению специфических Е-розеткообразующих клеток (Е-ROK). 3.1. Из гепаринизированной (20 ЕД/мл) крови обследуемого на градиенте плотности фиколл-верографина (р 1,077 г/л) выделяют лимфоциты. Тpижды отмывают их раствором Хенкса без ионов Са⁺⁺, подсчитывают их количества в единице объема с помощью камеры Горяева, готовят суспензию 2х10⁶ кл/мл на среде 199. 3.2. В центрифужной пробирке к 0,1 мл суспензии лимфоцитов больного доставляют 0,1 мл приготовленного диагностикума. Пробирку центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, затем помещают в термостат (t 37^oС) на 30 мин, а потом в холодильник (4^оС) на 19 с. По истечении времени инкубации пробирку встряхивают, фиксируют образовавшиеся розетки 6%-ным раствором глютарового альдегида (0,05 мл) в течение 20 мин при комнатной температуре. На обезжиренном стекле готовят мазок по типу толстой капли, высушивают на воздухе, 5 мин фиксируют метанолом, окрашивают водным раствором краски Романовского-Гимзы (приготовленной в разведении 1:40) в течение 20 мин. Микроскопируют с иммерсией (90х7), подсчитывают 200 лимфоцитов, в том числе лимфоциты, присоединившие 3 и более сенсибилизированных эритроцита. Приводимые ниже данные показывают необходимость и достаточность используемых в техническом решении приемов. Материалы (см.табл. 1-3) получены при обследовании 40 женщин с указанием на аллергию к пенициллину, либо его аналогам в анамнезе, доказанную в пробах in vitro в реакциях непрямой дегрануляции тучных клеток крыс (РНДТКК) повреждения нейтрофилов (РПН), специфического розеткообразования (РСРО) и непрямой геммаглютинации (РНГА). Степень сенсибилизации пенициллином определялась у них в динамике с помощью однократно приготовленного диагностикума с разными сроками хранения. При этом достоверной разницы в уровне сенсибилизации (по реакциям РСРО и РНГА) найдено не было. Сравнительная оценка концентраций ацетальдегида при стабилизации эритроцитарного диагностикума приведена в табл.1. Наиболее оптимальной является 5% -ная концентрация. При этом уровень спонтанных РОК с стабилизированными эритроцитами не превышает 4% Влияние времени стабилизации эритроцитов 5%-ным ацетальдегидом при 35-37^оС на длительность сохранения диагностикума в рабочем состоянии приведено в табл.2. Длительность хранения при данных режимах увеличивается до 18 мес. Сравнительная информативность и чувствительность стабилизированного эритроцитарного диагностикума и диагностикумов изготовленных ex temporae приведены в табл.3. Оценка возможности использования предлагаемого диагностикума в зависимости от срока хранения приведена в табл.4. Статическая значимость различий в показателях между начальными и последующими сроками хранения Р приведена в табл.5. Из табл.3 и 4 видно, что свойства предлагаемого диагностикума не изменяются при длительном хранении и не отличаются от свежеприготовленного. Приведенные материалы показывают, что универсальный эритроцитарный диагностикум сохраняется в активном состоянии в течение 18 мес. (срок наблюдения). Дальнейшее его применение целесообразно после предварительного контроля в параллельных экспериментах со свежеприготовленными диагностикумами. Положительный эффект предлагаемого технического решения заключается в появляющейся возможности хранения диагностикума по 1,5 лет с момента получения без снижения диагностических свойств. Он может быть использован для выявления в сыворотке крови противоантибиотиковых антител.

Формула изобретения

Способ приготовления эритроцитарного диагностикума для индикации лекарственной аллергии к антибиотикам путем сенсибилизации аритроцитов сенситином, отличающийся тем, что, с целью увеличения срока хранения диагностикума, перед сенсибилизацией, эритроциты предварительно стабилизируют 5%-ным раствором ацетатальдегида при 35 37^oС в течение 24 36 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 11-2002

Извещение опубликовано: 20.04.2002        

---