Способ определения в-лимфоцитов

 

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической иммунологии. Целью изобретения является упрощение способа и сокращение времени определения. Для этого после добавления к лимфоцитам люминесцирующей антиглобулиновой антисыворотки при прокрашивании на предметном стекле, его прогревают над пламенем спиртовки, тем самым сокращая время анализа на 3 ч и достигая упрощения способа.

СО!03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si>s 6 01 N 33/533

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ, : l )p/(i } .: -iA

Е (21) 4463707/30-14 (22) 19.07.88 (46) 30,10,90. Бюл, ¹ 40 (71) Научно-исследовательский институт онкологии и медицинской радиологии и Минский государственный медицинский институт (72) Д.Я. Рисина и С.А. Рисин (53) 615,375(088.8) (56) Зарецкая Ю,M. Идентифи:,: ция В-клеточных детерминант посредством техники двойного окрашивания -- Клиническая им= мунология, с. 61, 2, 3, б.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, к изу- чению иммунологического статуса, Цель изобретения — сокращение времени анализа и упрощение способа.

Способ осуществляется следующим об* разом.

Сухую люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека, меченную од-ним из флюоресцирующих агентов (например ФИТЦ, родамин или другой), растворяю- в .соответствии с инструкцией. Раствор освобождают от нераство° ряющихся примесей центрифугированием при 3000 o6/мин в течение 30 мин, Выделенные на градиенте верофиколла лимфоциты дважды отмывают сребдой 199 и готовят взвесь, содержащую 2 10 клеток в 1 мл взвеси. К 0,5 мл взвеси лимфоцитов добавляют равный обьем предварительно отцентрифугированной люминесцирующей антисыворотки, тщательно ресуспендируют и выдерживают при 37 С 20 мин при периодическом осторожном встряхивании.

„„. Ж„„1603306 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В-ЛИМФОЦИТОВ (57) Изобретение относится к области медицины, а именно клинической иммунологии.

Целью изобретения является упрощение способа и сокращение времени определения, Для этого после добавления к лимфоцитам люминесцирующей антиглобулиновой антисыворотки при прокрашивании на предметном стекле, его прогревают над пламенем спиртовки, тем самым сокращая время анализа на 3 ч и достигая упрощения способа.

Взвесь ггимфоцитов, обработанных антисы во ротко й, дважды отмы ва ют 8 — 10-кратным обьемом изатонического раствора

NaCl. Осадок тщательно ресуспендируют и каплю его переносят на предварительно обезжиренное предметное стекло.

К капле взвеси добавляют капиллярной пастеровской пипеткой небольшую каплю заранее приготовленного флюоресцирующего агента, способного прокрашивать лимфоциты и давать при просмотре в люминесцентном микроскопе иную по цветности флюоресценцию. Содержимое капли перемешивают, покрывают покровным стеклом и прогревают над пламенем горелки до 60ЯС.

В зависимости от особенностей исполь- зованного для прокрашивания лимфоцитов флюоресцентного агента препараты либо сразу микроскопируют, либо после дополнительной обработки, повышающей эффективность окрашивания; Далее препараты подвергают люминесцентно-микроскопическому исследованию. Подсчитывают число

1603306

Составитель Е,Васильева

Техред M,Mîðãåíòàë Корректор И.Муска.Редактор И,Касарда

Заказ 3382 Тираж 510 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 специфйчески светящихся В-лимфоцитов (точечное и кольцевое свечения) на 200 клеток, отчетливо идентифицирующихся в том же режиме микроскопии. Содержание Влим<Ьоцитов выражают в процентах.

Пример 1. Используют сухую кроличью люминесцирующую сыворотку npo" тив глобулинов человека производства

Института эпидемиологии и микробиологии им. H.Ô. Гамалея AMH СССР, меченную флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).

Поскольку антитела, меченные ФИТЦ, дают зеленое свечение, то для мечения лимфоцитов используется этидиум бромид, который окрашивает лимфоциты в красный цвет. Для приготовления рабочего раствора этидиум бромида 1 мг его растворяется в

250 мл изотонического. раствора NeCI (— 10 — 10 моль/л). Рабочий раствор хранится

-6 при +4 С.

Одну каплю рабочего раствора этидиум бромида добавляют непосредственно на предметное стекло во взвесь лимфоцитов, обработанных предварительно антиглобулиновой сывороткой, меченной ФИТЦ.

Предметное стекло покрывают покровным и прогревают, равномерно пронося над пламенем спиртовки, до =450 С. При этом обеспечивается эффект окрашивания лимфоцитов, Далее препарат подвергают люминесцентной микроскопии с использованием иммерсионной системы (возбуждающий свет 480-700 нм, запирающие светофильт5 ры ЖС18+ЖЗС19), Лимфоциты при этом дают равномерное красное свечение, а

В-лимфоциты — дополнительно специфическое точечное или кольцевое зеленое свечение, обусловленное связанными

10 антиглобулиновыми антителами, меченными ФИТЦ.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить определение общего количества лимфоцитов, дискриминировать

15 В-лимфоциты и уменьшить время анализа наЗч.

Формула изобретения

Способ определения В-лимфоцитов путем выявления поверхностных иммуногло20 булинов с помощью добавления к лимфоцитам люминесцирующей антиглобулиновой антисыворотки и окрашивания на предметном стекло флюоресцирующим агентом, отличающийся тем, что, с

25 целью сокращения времени анализа и упрощения способа, в процессе скрашивания лимфоцитов флюоресцирующим агентом предметное стекло прогревают над пламенем горелки до 60 С.