Способ получения пептидов и белков в бесклеточной системе трансляции

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к использованию бесклеточных систем трансляции для синтеза биологически активных полипептидов in vitro . Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта за счет увеличения срока работы системы трансляции. Способ препаративного синтеза полипептидов и белков в бесклеточной системе трансляции непрерывного действия предполагает непрерывный отвод из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывное восстановление исходной концентрации низкомолекулярных веществ, расходующихся в процессе трансляции.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (!9) (и) (51) 5 С I? Р ?1/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМЪГ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4239148/13 (22) 29.04.87 (4б) 07.01.91. Бюл. ¹ 1 (71) Институт белка AH СССР (7?) И.II Алахон, В.И.Баранон9

С.П.Оводов, Л.А,Рябова и А.С.Спирин (53) 577.217. 3(088.8) (56) Roberts В.Е. and Paterson B.М.

PNAS. 1973, v.70, N 8, р.2330-?334. (54) СПОС()Б ПОЛУЧГНИЯ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ В БГС)<ЛНТОЧНОЙ СИСТРЛЕ ТРАНСЛЯЦИИ (57) Изобретение относится к молеку— лярной биологии и биотехнологии, а

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии,а именно к использованию бесклеточных систем трансляции для синтеза биологически активных полипептидов in vitro

Целью изобретения является повыше— ние выхода целевого продукта за счет увеличения срока работы системы трансляции.

На Аиг.1 и 2 приведены схемы, поясняющие способ.

Разработан целый ряд бесклеточнь|х систем трансляции на основе клеточных экстрактов из различных прокариотических и эукариотических организмов. Rce эти системы характеризуются низкои эААективностью процесса и обычно обеспечивают синтез лишь нескольких молекул полипептида на рибосому. Основные при;ины столь низкой эффективности бесклеточных систем трансляции

2 имеHHo к использованию бесклеточных систем трансляции для синтеза биопогически актинн=.:; полипептидов 1п чдt

ro. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта за счет увеличения срока работы системы трансляции. Способ препаратинного синтеза полипептидов и белкон и бесклеточной системе трансляции непрерывного действия предполагает непрерывный отвод из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывное восстановление исходной концентрации низкомолекулярных веществ, расходуюши:вся н процессе трансляции. состоят и том, что бесклеточные системы трансляции содержат ограниченное количество субстратов реакции, в первую очередь источников энергии (АТР и ГТР) . Повышение содержания этих компонентов н системах имеет определенные пределы, при превышении которых наблюдается ингибирование системы трансляции. Продукты распада субстратов реакции, н первую очередь

ADP, AIIIР, CDP, АосАаты и пироо)осАаты, являются ингибиторами системы трансляции. Сами продукты синтеза (полипептиды) также могут быть,ингибиторами отдельных стадий бесклеточной системы трансляции.

Описанные причины устраняются за счет непрерывного отвода из реакционной смеси продуктов реакпии и непрерынногo восстановления исходной KOH

1618761 центрации низкомолекулярных веществ, расходующихся в процессе трансляции.

Основная реакция (синтез) полипептида протекает в блоке 1 (Фиг. 1) . В результате ее расходуются свободные аминокислоты, ATP и СТР и образуют1 полипептид, АМР, GDP и неорганический фосАат. Дпя предотвращения остановки процесса из блока 1 происходит одновременно отбор ГОР, AMP и Р„и подача ,GTP, ATP и аминокислот из блока 2.

Отбор синтезируемого полипептида происходит (в блоке 3) через мембрану в резервуар, из которого буферный 15 раствор с полипептидом поступает в колонку с айфннним иммуносорбентом.

На колонке происходит адсорбция полипептида на иммунном сорбенте, специфичном к целевому полипептиду. Для 20 более экономичной работы системы в блоке 4 происходит превращение образовавшихся АМР и GAP в АТР и GTP. Вуферный раствор из блока 3 после ад сорбции полипептида также проходит 25 через систему регенерации АТР и ГТР и через полупроницаемую мембрану вновь поступает в реакционную смесь.

Пример 1. Синтез белка оболочки вируса мозаики костра (RNV) Hà 30 матрице ВМ 7 РНК 4 в эукариотической системе трансляции из зародышей пшеницы в стандартной системе и в установке непрерывного действия.

Раствор (А) состоит из 20 MM НГPES, рН 7,6, 2,1 мИ М@(оАс), 115 мИ

КоАс, 1 мМ АТР, 25 мкМ ГТР, 250 мкМ спермидина, ?5 мкИ t Н) лейцина с удельной радиоактивностью 24 Ки/ммоль и 25 мкМ каждой из остальных 19 ами- 40 нокислот. 3 мл инкубационной смеси, приготовленной на растворе (А), содержит 80 пмоль 08 S рибосом, 20 пмоль

ВМ РНК 4, 3,7 on.åä. А о белковой

Аракции S100, 150 ед. активности ин- 45 гибитора рибонуклеаз из плаценты человека, О, 1 мкг лейпептина, О, 1 мкг апротенина, 0,1 мкг пепстатина,0 1 мкг химостатина.

KHHeTHKR синтеза белка оболочки 50 в стандартной системе при 25 С предо ставлена на фиг.? (кривая 1) .

В параллельном эксперименте в установке непреривного действия к 3 мл

ТоН же инкубационной смеси непрерывно подается раствор (А) со скоростью

0,6 мл/ч, а продукты реакции отводятся из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационную мембрану ХМ вЂ” 50. В результате в камеру, содержащую бесклеточную систему трансляции, непрерывно подаются субстраты реакции (АТР, ГТР, аминокислоты) и отводятся из нее продукты реакции (ANP, ГПР, Р;, синтезированный белок оболочки).

Кинетика синтеза .белка оболочки в такой системе при 25 Г в течение 15 ч представлена на Аиг.2 (кривая 2).

Из сравнения кинетических кривых 1 и 2 (Аиг.2) можно сделать следующие выводы.

Стандартная бесклеточная система трансляции выходит на плато по синтезу белка через 1,5 ч.Количество синтезированного белка при этом составляет 0,76 пмоль белка оболочки на 1 пмоль рибосом.

В установке непрерывного действия синтез белка оболочки идет линейно в течение исследованного интервала времени (15 ч), количество синтезированного белка за 15 ч 40 пмоль на

1 пмоль рибосом.

В целом для предложенной модели установки непрерывного действия эАфективность синтеза белка за 15 ч возрастает более чем в 50 раз.

Н р и м е р 2. Синтез белка оболочки Aara М$ 2 на матрице 2 MS 2 PHK в прокариотической системе трансляции E.ñî1i в стандартной системе и в установке непрерывного действия.

Раствор (A) содержит 20 мМ трис-НС1, рН 7.,4, 10 мМ NgC1, 100 мМ

ИН4С1, 1 MN APT, 0,2 мМ ГТР, 5 MM креатин фосА<.та, 10 мкг/мп кр. Aoc— фаткиназы 25 мМ ) С лейцина с

14, . удельной радиоактивностью 348 мКи/

/ммоль и 25 мкМ каждой из остальных аминокислот. 3 мл инкубационной смеси, приготовленной на буАере (А), содержат 1 нмоль рибосом 70S 1 нмоль

ИЯ2 РНК, 3,5 ед Аадо белковой Фракции S100.

В параллельном эксперименте в установку непрерывного действия к 3 мп той же инкубационной смеси непрерывно подают раствор (А) со скоростью

0,5 мл/ч, а продукты реакции отводятся из реакционной смеси с той же скоростью через ультраАильтрационную мембрану РМ-ЗО.В результате в камеру, содержащую бесклеточную систему трансляции, непрерывно подают субстраты реакции (АТР, ГТР,аминокисло5

161 ты) и отводят продукты реакции (Л11Р.

ГОР, Р, синтезированный белок) .

У - (Э

Стандартная бесклеточная система трансляции выходит на плато по синтезу белка через 2 ч. Количество синтезированного белка при этом составляет

1,! пмоль белка на 1 пмоль рибосом.

Сравнивают кинетику синтеза белка оболочки в такой системе при 370С в течение 15 ч с кинетикой синтеза в стандартной бесклеточной системе.

В установке непрерывного действия в течение 15ч синтезировано 11пмоль белка на 1 пмоль рибосом.

Таким образом, предлагаемый способ синтеза полипептидов в бесклеточной системе трансляции обеспечивает многократное повышение скорости реакции и функционирование системы в длительном режиме. В результате этого выход целевого продукта повышается в несколько десятков раз (по сравнению с прототипом).

Достигаемая эААективность процесса позволяет использовать способ дпя препаративного синтеза активных полипептидов и белков. Особо важное хо8761 зяйственное значение может иметь получение этим способом полипептидов длиной 15-50 аминокислотных остатков, поскольку производство их химическим путем является крайне дорогостоящим, а для методов генной инженерии — во многих случаях малодоступным.

Формула изобретения

Способ получения пептидов и белков в бесклеточной системе трансляции с

% использованием матричных PHK c после15 дующим выделением и очисткой конечногопродукта,отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта за .счет увеличения срока работы системы трансляции,осуществляют непрерывное удаление из реакционной смеси синтезированного продукта, непрерывное восстановление концентрации расходуемых низкомолекулярных веществ аминокислот, АТР., ГТР, регенерацию АТР и ГТР из образующихся

AMP н ГЛР с последующим возвращением регенерированных ATP и ГТР в систему трансляции.

1618761

Составитель О.Скуратовская

Т ехр ед М. Дидык Корр ек тор T . Палий

Редактор Н.Гунько

Тираж l/

Заказ 23

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101