Вектор pps-4-neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к генетической инженерии . Целью изобретения является конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих , а также обеспечивающего простые способы клонирования генов в состав вектора. Вектор pPS-4-neo размером 10 т.п.о. и емкостью до 7 т.п.о. имеет уникальные сайты рестрикции Sail, Hindlll, BamHI и EcoRI для клонирования чужеродных генов под контроль промотора ретровируса, а клонирование генов с собственным промотором осуществляется по сайту рестрикции Clal. Вектор обеспечивает устойчивость клеток млекопитаюпщх к генетицину и метатрексату, а клеток Е. со- li - к канамицину и ампициллину. с 9 С с

СООЭ СОВЕТСКИХ

СОЩИАЛИСТИЧЕСКИХ

ЩСПЬ ВЛИН щ)g C 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

APH fHHT СССР

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4649320/13 (22) 30,12.88 (46) 23 01.91. Вюл. М 3 (71) Институт молекулярной биологии им.В.A.Ýíãåëüãàðäòà и Институт биоорганической химии им.М.М.Р1емякина (72) F..È.фролова, И.С.Павлова, М.Л.Маркелов, П.М.Чумаков и В.С.Прасолов (53) 757.224.2.577,2(088.8) (56) Williams D.К. et al T.Eõp. Мед. (1987), v.б, М 7, рр. 2053-2060., (54) ВЕКТОР pPS-4-1ТО 1ЛЯ ВВЕДЕНИЯ И

ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАКМЧИХ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инИзобретение относится к биотехнологии, а именно к генетическсй инженерии, представляет интерес для различного рода научных исследований, в частности для изучения разного рода факторов дифференцировки и пролиЬерации, а также для получения линий клеток - продуцентов практически ценных белков.

Пель изобретения — конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих, а таК å обеспечивающего простые и удобные способы клонирования генов в состав вектора.

R вектор pPS-neo, содержащий синтетический полилинкер, вяогят ген

DHFR, г1ааогялий1ся под, контролем раннего г1ремотора вируса Sh 40.

„„Я0„„1622395 A 1

2 женерии. Целью изобретения является конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генон в клетках млекопитающих, а также обеспечивающего простые способы клонирования генов в состав вектора. Вектор pPS-4-пео размером 10 т.п.о. и емкостью до 7 т.п.о. имеет уникальные сайты рестрикции

Sall, HindIII, ВашНТ u EcnRI для клонирования чужеродных генов под контроль промотора ретровируса, а клонирование генов с собственным промотором осуществляется пп сайту рестрикции Clal Вектор обеспечивает устойчивость клеток млекопитающих к генетицину и метатрексату, а клеток F,.cnli — к канамицину и ампициллину.

Ретровирусный вектор pPS-4-пео характеризуется следующими свойстнами. Размер вектора около 10 т.п.n., емкость встраиваемой ДНК вЂ” до 7 т.п.п.

Вектор состоит из: линейной Аормы векторной плазмиды рЯР64, у которой полилинкер заменен единичным сайтом FcoRI, плазмггда содержит ген устойчивости к ампицг1ллину, двух фрагментов превируса лейкоза мышей Молони, включающих и правый 1.ТР, область Ц, ответственную за упаковку полных транскриптов ретровирусной конструкции в вирусопопобные частицы, а также прилегающие к 1,TR участки клеточной fHK, полилинкера, содержащего сайты рестрикции (Яа1I

HindIII, Ва1I, BamHI, FcoRI), по которьгм пре.- полагается клонирование

ЧУжЕРОДН1 I ЕНг Г1, ДЯУХ УЧаСтКГ В На1622395

30 чала репликации вируса SV40, содержащих также ранний промотор вируса, гена пео, определяющего устойчивость клеток млекопитающих к гене5 тицину и F,.coli - к канамицину, сигнал для сплайсинга из ранней области вируса SV40, ген» дигидрофолатредуктазы,мьппи, обеспечивающего устойчивость к метатрексату, уникальные сайты рестрикции HindIII, BamHI, EcoRI, NotI, ClaI, встраивание чужеродных генов под контроль промотора ретровируса производится по сайтам SalI, HindIII, BamHI, EcoRI, !5 встраивание чужеродных генов, находящихся под контролем собственных промоторов, производится по сайту

ClaI, левее гена пео.

В ДНК вектора pPS-3-пео вводят 20 специально сконструированный блок, состоящий из гена РНРК, находящегося под контролем раннего промотора

SV40. Конструкция блока состоит в следующем. Ген DHFR встраивают в 25 плазмиду pSVRpt вместо гена Гр, сайт

PvuII слева от промотора заменяют на сайт FcoRI, а сайт HindIII справа от промотора — на сайт NotI. Зачтем готовый блок встраивают в вектор

pPS-3-пео.

Введение чужеродных генов в клетки млекопитающих с помощью вектора

pXS-4-пео осуществляется в два этапа.

1. ЛНК вектора pPS-4-пео с встроенным в него геном вводят методом

ДНК-трансфекции в клетки, экспрессирующие структурные белки вируса лейкоза мышей (клетки (2 или подобные).

2. После селекции клеток, экспрес-40 сирующих ретровирусный конструкт, на среде с генетицином (g 418) производят сбор вирусоподобных частиц иэ среды культивирования клеток и заряжают клетки, в которых предпола- 4 гается проводить экспрессию чужеродного гена. Для повышения уровня экспрессии гена в клетках используется амплификация вирусного материала в клетке на среде с метатрексатом.

Наработка ДНК вектора pPS-4-пео производится в клетках F..coli.

Пример 1. Конструирование вектора pPS-4-пео.

А. Получение блока, содержащего ген ПНРК мыши,под контролем раннего промотора SV40.

Клонирование гена ПНГК в плазмиде pSCgpt. Плазмиду рЯЧрр расщепляют EcoRI и HindIII, меньший фрагмент, содержащий промотор SV40, ген устойчивости к ампициллину и oripBR

322 выделяют электрофорезом в легкоплавкой агарозе (LMPA) нлигируют с большим фрагментом плазмиды ИИТ ЧВНРР, расщепленной FcnRI u HindIII обработанной фосфатазой и очищенной электрофорезом в 1.ИРА. Е результате получают плазмиду р1, содержащую ген

DHFR под контролем раннего промотора SV40i

Получение плазмиды р2. Плазмиду р1 расщепляют Pvull, дефосфорилируют с помощью фосфатазы из тимуса теленка (CIP), очищают электрофорезом в 1.ЯРА и лигируют синтетическим

8-членным FcoRI линкером. В результате получают плазмиду р3, содержащую слева от промотора SV40 сайт FcnRI.

Получение плазмиды рЗ. Плазмиду р2 расщепляют HindIII, обрабатывают

CIP, очищают электрофорезом в !ЯРА и лигируют с синтетическим NotI лин-. кером. В результате получают плазмиду р3, содержащую справа от промотора

SV40 сайт NotI.

Б, Получение вектора pP$4

Удаление двух ГсoRI сайтов на концах сегмента pSP64 вектора pPS-1-neo: плазмиду pPS-I-neo переводят в линейную форму частичным гидролиэом EcnRI, обрабатывают фрагментом Кленова ДНКполимеразы I в присутствии четырех

DNTP и лигируют. Полученную плазмиду

pPS-1,5-пео, содержащую два FcnRI сайта — в полилинкере и слева от 1.TR переводят в линейную форму частичным гидролизом ЕсоКХ, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии четырех dNTR и лигируют..

Полученная плазмида pPS-2-пео содержит уникальный Есор? сайт, расположенный в области синтетического полилинкера.

Удаление BamHI сайты справа от гена пео в плазмиде pPS-2-пео. Плаз миду pPS-2-пео переводят в линейную форму частичным гидролизом BamHI, обрабатывают фрагментом Кленова

ДНК-полимеразы 1 в присутствии четырех dNTP и лигируют. Полученная плазмнда pPS-3-пео содержит уникальный ВашНТ сайт в области синтетического полилинкера.

Клонирование блока ранний промотор SV40 — ген DHFR в плазмипе

pPS-3-пео. Плазмиду р3 расщепляют

16?2395 6 на в клетках при их культивировании на среде с метлтрексатом.

Формула и з о б р е т е н и я

Вектор pPS-4-пео для внедрения и экспрессии генов и культивируемых соматических клетках млекопитающих размерон 10 т.п.о. и мол.м. 6,6 Nd н содержащий плазмилную ДНК pPS-I-neo размером 9,6 т.п.о. и мол.м. 6,34 Nd, в которой удалены оба участка уэнавання рестрикционной энлонуклеаэы

EcoRI н .составе FcoRI — EcoRI фраг40

Составитель С.Бандурин

Техред JI.Îëuéíûê Корректор М,Демчик

Редактор Н.Яцола

Заказ 88 Тираж Подписное

ВНИКЛИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

EcoRI u Bp1 Il, вселяют менмпий

1,6 т.п.н. фрагмент электрофорезом в 1.МРА и клонируют его в пллэмиде рРБЗ, расщепленной FcoRI u

Bg1II и очищенной электрофореэом н

LMPA, В результате получают пллэмиду р4.

Получение вектора pPS-4-пео. Ллаэмиду р4 расщепляют В8111, достраивают липкие концы фрагментом Кленова ПНК-полимераэы I в присутствии четырех dNTP, обрабатывают HindIII, выделяют меньший фрагмент 1,6 т.п.н, электрофореэом í T,ÈPÀ и клонируют его в плаэмиле рР$-3-пео, обработанной последовательно FcnRI фрагментон

Кленова ДНК-полимерлэы T н присутствии четырех ЖТР, HindTIT u CIP u очищенной электрофореэом н 1.МРА. Полученная плазмилл является искомым вектором pPS-4-пео.

Пример 2. Экспрессия гена (-интерферона человека н клетках

RatI.

С помощью вектора pPS=4-пео постигают эффектинную экспрессию генл

1-интерферона человека н клетках RatI, составляющая 500 ед./мл н сутки. Увеличение уровня экспрессии генов, клонированных и векторе pPS-4-пео, достигается эа счет увели ения лози ге5

35 мента пла эмилы pSP 64 и удален участок узнавания рлстрикционпой эндонуклеаэы BamHI, находящийся нл расстоянии 0,3 т.п î. от участка узна1 вания для рлстрикционной эндонуклеаэы Clal н составе ретровирусной части pPS-I-neo, HindTII - Pvullфрагмент плазмидной /1HK pSVgpt размером 0,4 т.п.о. и мол.м. 0,26 Nd c участком начала репликлции (Ori) с промотором ранней oáëacòu вируса

SV40, в котором участок узнавания для растриктаэы Рчи11 заменен на участок узнавания для рестриктазы

EcoRI, а участок узнавания для рестриктазы HindTIT. заменен на участок узнавания для рестриктаэы NotI

HindII1 — Вр,1 Il — фрагмент пллзмилной ПНК pNNTVDHFR размером 1, 2 т.п.о. и мол.м. 0,79 Nd с геном лигилрофолатрелуктаэы (DHFR), н котором участок узнавания для рестриктазы

HindITI заменен нл NotI и удален участок узнавания для рестриктазы

Вд111 с помощью достраивания фрагментом Кленова J1HK полимераэы I: генетические маркеры; neo — определяющий устойчивость клеток млекопитаюших к генетицину (418) u Escherichia col i — к канам и пну, 1>РКТ обеспечинлюгвпt устойчивость к метатрексату, Ар — обеспечивающий устойг чиность к лмпициллину, уникальные ! слйты рестрикции: HindIII BamHT.

FcoRI, Вр,)11, ClaI, NotT., емкость вектора — ло 7 т,п,о. встраивание чужеродных генов под контроль промотора ретронирусл по сайтлм SalT., HindIII, BamHI и FcoPI, л встраивание чужеродных генов с собственным промоторомпо сайту С1а1, спектр хозяев — клетки млекопитающих, например фибробласты мьяпи (NTH3T3, Ва1Ь/с) фибробласты крысы (RatI и Rat2), клетки обезьяны - CosI.