Способ определения кардиотропной активности веществ

 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и фармакологии. Цель изобретения - повышение информативности за счет оценки генеза активности. Для этого капиллярную мышцу извлекают. помещают в пита-эльный раствор с температурой 24-26°С, в который добавляют 3 10 8-3-107 М изадрина. Затем проводят стимуляцию мышцы с частотой 0,5 Гц. После этого определяют максимальную скорость напряжения и расслабления мышцы до и после введения препарата. После этого находят прирост скорости напряжения и скорости расслабления мышцы после введения исследуемого вещества. В зависимости от сооношения полученных данных судят о механизме действия вещества на миокард. Применение способа позволяет, в отличие от прототипа, определять механизм действия вещества на миокард за счет оценки влияния вещества на потоки кальция в миоплазму. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю G 01 N 33/15

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4354515/14 (22) 04.01.88 (46) 15.03.91. Бюл. М 10 (71) Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра

АМН СССР (72) Б.И. Лаптев, С.А. Богомаз, Е.М, Кулагин, С.А. Афанасьев и В.Д. Прокопьева (53) 615.475(088.8) (56) Bogdanov К.1. et а! Can. J, Physiol, and

PharmacoI. 1979. Ч, 57, п 7, р. 86ь-872. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРДИОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и фармакологии.

Цель изобретения — повышение информативности эа счет оценки генеза активности.

Для этого капиллярную мышцу извлекают, Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и фармакологии.

Цель изобретения — повышение информативности эа счет генеза активности.

Способ осуществляют следующим образом.

Для исследования берут морских свинок обоего пола весом 200 — 400 г. Животных забивают ударом по голове. Сердце быстро извлекают стандартным способом и помещают в охлажденный (6 ч-2 С) физиологический раствор для прекращения сердцебиений. После остановки сердца разрезают стенку правого желудочка и выделяют папиллярную мышцу.

Выделенную папиллярную мышцу помещают в термостатированную перфузионную камеру объемом 0,6 мл. Сократительную функцию папиллярной мышцы изучают в изометрическом режиме. Для это.. Ж 1635133 Al помещают в пита.ельный раствор с температурой 24 — 26 С, в который добавляют

3 10 — 3 10 М изадрина. Затем проводят стимуляцию мышцы с частотой 0,5 Гц. После этого определяют максимальную скорость напряжения и расслабления мышцы до и после введения препарата. После этого находят прирост скорости напряжения и скорости расслабления мышцы после введения исследуемого вещества. В зависимости от сооношения полученных данных судят о механизме действия вещества на миокард, Применение способа позволяет, в отличие от прототипа, определять механизм действия вещества на миокард за счет оценки влияния вещества на потоки кальция в миоплаэму. го сухожильный конец мышцы при помощи нитки соединяют со штырем механотрона а второй конец закрепляют, например, зажимом, соединенным со стенкой перфуэион-,( ной камеры, Первоначальную силу () натяжения мышцы устанавливают 0,5 r. ;Ql

Перфузию проводят со скоростью

6 мл/мин при 24 — 26 С раствором следующего состава, в мМ: Na CI 120; KCI 4,8; CaClz 2,0;

MgCIz 1,2; КН2РО4 1,2; МаНСОз 25; глюкоза

10. Раотвор насищаюг газовом смесью 95 $ного Оа н огвг-ного СОг. рН раствора после насыщения составляет 7,4 0,05, а

Мышца сокращается под влиянием электрической стимуляции прямоугольными импульсами, величиной больше пороговой на 15-20, длительностью 5 мс, с частотой 0,5 гЦ. Длительность периода адаптации — 60 мин, В конце этого периода силу натяжения папиллярной мышцы увеличива)от <)0 )> 14I») rl )>i )лак< н"! -!5) t.: !3)f ci i!) ы 0КращЕНИй l1 3T), СИЛУ 1!3Г5)Н а)) л Поддвр ))вают до конца nr) i,! r3.

После окс)н )лннг):,аптац) lи ii перф, 3;I

ОННый р3С f)30!> )3)!0,5)1 ))з>3/113!1! . ) <0Н цаl t3 рации > 10 -3 !О Ы.

После стабили f;»i,;I;) .!3) tëfii, i !»!.! сокращения и па!Замет!)ов v..: )гr,пой )!)о)«вводной эти кривые оегистрируют. 33)ем 13 перфуэионньпл р)cTl)op в)одл определанную Ko)4)IBIITp3)jplo ifc".лалуемг 0 )е дегтла, После стабилизац.;;; ампл: ...,::; ы:с-ок)3»3 щения и параметров = i ар"ой произ-од ной эти кривые по))гор), о р;.r:4c) !-.иру)ог

Иэ до);ум нт );,l:i)bi> ",: .. i)! i

ПЕРВОЙ ППоиэиоДНпй СИЛ) .. .,: )Е!)!)) Па пиллЯРНОЙ мbl)1)L!, I f1,)пс "0".! сE.Н! I: I 0пPаД ляют максимальнуi!: с;-;0г)псT, : пoвь)ыа)!«)л напрлже!)ил l)bll!)lib! посла до,)3)35)е))иг! перфузион))ый р;<с 30р исс5)аугуамого вао аства, максимг) аную с«опасть повышения напряженил до добавления 0 парфуз10

ОТНОШЕНИЕ. Т,О ПРИРОСТ СКОРОСТИ НЗПРЛжанил, 3 также максимальну.; скорость р;)сслабления мышцы посла добавленил в перфузионный растааг) )лссг)аг)35а)10го леща ства, максимальную ск .рс, расL..; абла .:... до добавления в перфузио )ы:. 030TBOp l,iследуемого вещества, ик с r,! »!ие:4иа, прирост скорости расслабла);,!.!. Еc I по! рост скорости напрлже!): л и )3;.ссг),)бл:Ii!45 больше 1,0 и первый ма))ь )а —,торо)о, ro определя)от поло>«и- ель)tf tL) инотр0пl),II., эффект используемой Kotl а))тра)»)и l,!3ii, ствд, связан н ы и с акти В а ц IF )1 в > Ода !< 3 Ii b! i ii

»Top0r0 г0 опрсделл)от отрицательный инотропный эффект используемой концентра5,ии в:::-.)цества, свлзанный со снижением посгуг)лепил ионов кальция в миоплазму в

;.0pe сардеч)-)ого цикла через сарколемму и лэ саокоплазматического ретикулума, но в бол),шай степени — через сарколемму.

Если г)рирост скорости напряжения и расслабления меньше 1,0 и первый меньше вгорою, r0 определяют отрицательный иногрппный эффект используемой концентраi5 ции веьцаства, связэнный со снижением

f.rcTóï)I0fIèë и0нов кальция в ми0плаэму чераз,:арксла)1му и иэ саркоплаэматического

;LrrffKó5),,.43, нс )3 большей степени — из сар)<оплаз )ат!)час«ого ретикулума. .::0 Если г1риро;T скорости сокращения и ,)асc)13(3ë3)II)5! мышцы равны 1,0, то определл)0), что исследуемое вещество в используа))ои концентрации на миокард не ,»ейс л уат.

25 П р и ).1 а р 7. Для исследования берут орскую свинку весом 250 г, Животное забива)от ударом по голове. Сердце быстро извлакаloT cTрандартным способом и по..ща:а, f3 охлажденный (б + 2 С) физиопгичаский раствор до прекращения сердц 1)1аHviL4, После остановки сердца разрезаю; с генку правого н<елудочка и выделя:ат l!3il! лллрную мышцу.

Выделенную папиллярную мышцу

7> помеща)от в термостатированную перф,:зион))у)о камеру обьемом 0,6 мл. Сокра3НГСлЫ)У)0 ФУНКЦИЮ ПаПИЛЛЯРНОй МЫШЦЫ изуча)о г !3 изометрическом режиме. Для этоухожильный конец мышцы при помощи

Ф" ):итки соадиня)от со штырем механотрона

:ипа 5!3)1XlC, а второи конец закрепляют зажимом. соединенным со стенкой перфузионной камеры, Первоначальную силу

)агяже)!Ил мышцы устанавливают 0,5 г.

4! Парфузи)о проводят со скоростью

:::..5)/мин при 25 С раствором следующего ..остава, i3 мМ; МаС! 120; КС! 4,8; СаС!г 2,0;

",10r!z 1,2. KHzPOq 1,2; МаУСОз 25; глюкоза

"О. Раст оор нас ыща)от газовой смесью 95 . =.! ншо О;) и 5 Я,-ного СО2, рН раствора после

i;эсыщенил составляет 7,4 0,05.

f ib)LuLLa сокращается под вяиянием

;)5 а:<трической стимуляции прямоугольными импульсами, величиной больше порого5 -. г)пй на 15 — 20, длительность 5 мс, с часто10й 0,5 гЦ. Длительность периода адаптации — бО мин. В конце этого периода силу натл>кенил папиллярной мышцы увеличива)о) до развития максимальной силы со1635133 кращения и эгу силу натяжения поддерживают до конца опыта.

После окончания периода адаптации е перфузионный раствор вводят изадпин в концентрации 3 10 М, После стабилиза-в ции амплитуды силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые регистрируют, Затем дополнительно вводят изадрин. После стабилизации амплитуды силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые повторно регистрируют.

Из документальных записей FlEðâoé производной силы сокращения папиллярной мышцы морской свинки определяют максимальную скорость повышения силы сокращения после повышения в перфузионном растворе концентрации изадрина (14,6 г/с), максимальную скорость повышения силы сокращения до повышения в ïåðфузионном растворе концентрации изадрина (10,6 г/с), их отношение (1,38), а также максимальную скорость расслабления после повышения в перфузионном растворе концентрации изадрина (17,7 г/с), максимальную скорость расслабления до повышения в перфузионном растворе концентрации иэадрина (6,3 г/с), их отношение (2,81).

В данном примере при повышении концентрации изадрина значения прироста скорости сокращения и расслабления больше 1,0 и первый меньше второго. Исходя из этих результатов определяют положительный инотропный эффект повышения концентрации иэадрина, связанный с активацией входа кальция в миоплазму в ходе сердечного цикла через сарколемму и из саркоплазматического ретикулума, но в большей степени — через сарколемму. Это заключение соответствует имеющимся представлениям о механизме действия агонистов j3 -адренорецепторов, вызывающих повышение входа кальция в кардиомиоциты по медленным кальциевым каналам.

Исходная кривая силы сокращения папиллярной мышцы не имеет выраженной двухкомпонентной структуры и, следовательно, не может быть использована для определения механизма действия вещества на миокард по методике, изложенной в прототипе.

Пример 2. Для исследования берут морскую свинку весом 300 r, Животное забивают ударом по голове. Сердце быстро извлекают стандартным способом и помещают в охлажденный (6 + 2 С) физиологический раствор до прекращения сердцебиений. После остановки сердца раз5

55 резают стенку правого желудочка и выделя--ют папиллярную мышцу.

Выделенную папиллярную мышцу помещают в термостатированную перфузионную камеру объемом 0,6 мл. Сократительную функцию папиллярной мышцы изучают в иэотермическом режиме. Для этого сухожильный конец мышцы при помощи нитки соединяют со штырем MGxBHOTpOHB типа 6МХ1С, а второй конец закрепляют зажимом, соединенным со стенкой перфузионной камеры. Первоначальную силу натяжения мышцы устанавливают 0,5 г.

Г1ерфуэию проводят со скоростью

6 мл/мин при 24 С раствором следующего состава, в мМ: NaCI 120; KCI 4,8; СаС12 2,0;

MgClz 1,2; КН2Р04 1,2; йаНСОз 25; глюкоза

10. Раствор насыщают газовой смесью 95 ного 02 и 5 -ного СОг, рН раствора после насыщения составляет 7,4 + 0,05.

Мышца сокращается под влиянием электрической стимуляции прямоугольными импульсами, величиной больше пороговой на 15-20, длительностью 5 мс, с частотой 0,5 Гц. Длительность периода адаптации — 60 мин. В конце этого периода силу натяжения папилля рной мышцы увеличивают до развития максимальной силы сокращения и эту силу натяжения поддерживают до конца опыта.

После окончания периода адаптации в перфузионный раствор вводят изадрин в концентрации 3 10 М и эту концентрацию

-7 сохраняют до конца опыта, После стабилизации амплитуды силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые регистрируют. Затем в перфузионный раствор добавляют оуабаин в концентрации

10 M. После стабилизации. амплитуды силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые повторно регистрируют.

Из документальных записей первой производной силы сокращения папиллярной мышцы морской свинки определяют максимальную скорость повышения силы сокращения после добавления в перфузионный раствор оуабаина (10,4 г/с), максимальную скорость повышения силы сокращения до добавления в перфузионный раствор оуабаина (4,1 г/с), их отношение (2,51), а также максимальную скорость расслабления после добавления в перфузионный раствор оуабаина (9,7 г/с). максимальную скорость расслабления до добавления в перфузионный раствор оуабаина (4,0 г/с), их отношение (2,42).

В данном примере после добавления в перфузионный раствор оуабаина прирост скорости напряжения и расслабления боль1835133 шв 1,0 и первый больше второго, Исходя иэ этих результатов определяют положитель= ный инотропный эффект добавления в перфузионный раствор оуабаина, связанный с

° ктиввцивй входа кальция в миоплаэму в ходе сердечного цикла через сарколемму и из свркоплазматического ретикулума, но в большей степени — из саркоплазматического рвтикулума, Это заключение соответствует имеющимся представлениям о механизме действия сердечных гликоэидов, увеличивающих вход кальция через сарколемму путем натрий-кольциевого обмена.

Исходная кривая силы сокращения папиллярной мышцы не имеет выраженной двухкомпонентной структуры и, следовательно, не может быть.использована для определения механизма действия вещества на миокард по методике, изложенной в прототипе, Пример 3. Для исследования берут морскую свинку весом 280 г, Животное забивают ударом по голове. Сердце быстро извлекают стандартным способом и помещают в охлажденный (6 +.2 С) физиологический раствор до прекращения сердцебиений. После остановки сердца разрезают стенку правого желудочка и вы;,еляют папиллярную мышцу.

Выделенную папиллярную мышцу помещают в термостатированную iepфузионную камеру объемом 0,6 мл. Cur,I.àтительную функцию папиллярной мышцы изучают в изометрическом режиме. Для этого сухожильный конец мышцы при помощи нитки соединяют со штырем механотрона типа 6MXIC, а второй конец закрепляют зажимом, соединенным со стенкой перфузионной камеры. Первоначальную силу натяжения папиллярной мышцы устанавливают 0,5 г.

Перфузию проводят со скоростью

6 мл/мин при 26 С раствором следующего состава, в мМ: NоС1120; KCI 4,8; CaClz 2,0;

МцО2 1,2; КН "04 1,2; МаНСОэ 25; глюкоза

10, Раствор насыщают газовой смесью 95 ного Ог и 5;(,-ного С02, рН раствора после насыщения составляет 7,4 - 0,05, Мышца сокращается под влиянием электрической стимуляции прямоугольными импульсами, величиной больше пороговой на 15 — 20, длительностью 5 мс, с частотой 0,5 Гц. Длительность периода адаптации — 60 мин. В конце этого периода силу натяжения папиллярной мышцы увеличивают до развития максимальной силы сокращения и эту силу натяжения поддерживают до конца опыта.

После окончания периода адаптации в перфуэионный раствор вводят извдрин в концентрации 3 10 М и эту концентрацию сохраняют до конца опыта, После стабилизации амплитуды силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые регистрируют, Затем в перфузионный раствор добавляют верапамил в концентрации

10" М, После стабилизации силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые повторно регистрируют. Из документальных записей первой производной силы сокращения папиллярной мышцы морской свинки определяют максимальную скорость повышения силы сокращения после добавления в перфуэионный раствор верапамила (3,3 г/с), максимальную скорость повышения силы сокращения до добавления в перфузионный раствор верапамила (6,6 r/с), их отношение (0,49), а также максимальную скорость расслабления после добавления в перфуэионный раствор верапамила(3.3 г/c), максимальную скорость расслабления до добавления в перфузионный раствор верапамила (10 г/c), их отношение (0,33).

8 данном примере после добавления в перфуэионный раствор верапамила прирост скорости сокращения и расслабления мышцы меньше 1,0 и первый больше второго. Исходя их этих результатов определяют отрицатльмый инотропный эффект добав ения в перфузионный раствор верапамила, сея .àííûé со снижением поступления ионов кальция в миоплазму в ходе сердечного цикла через сарколемму и из саркоплаэматического ретикулума, но в большей степени — через сарколемму, Это заключение соответствует имеющимся представлениям о механизме действия блокаторов входа кальция, снижающих вход этого катиона по медленным кальциевым каналам.

Исходная кривая силы сокращения папиллярной мышцы имеет недостаточно выраженную двухкомпонентную структуру, что затрудняет ее использование для определения механизма действия вещества на миокард по методике, изложенной в прототипе.

Пример 4. Для исследования берут морскую свинку весом 290 г. Животное забивают ударом по голове. Сердце быстро извлекают стандартным способом и помещают в охлажденный (6 + 2 С) физиологический раствор до прекращения сердцебиений, После остановки сердца разрезают стенку правого желудочка и выделяют папиллярную мышцу.

1635133

5

Выделенную папиллярную мышцу помещают в термостатированную перфузионную камеру объемом 0,6 мл. Сократительную функцию папиллярной мышцы изучают в изометрическом режиме, Для этого сухожильный конец мышцы при помощи нитки соединяют со шть(рем механотрона типа 6МХ1С, а второй конец закрепляют зажимом, соединенным со стенкой перфузионной камеры. Первоначальную силу натяжения папиллярной мышцы устанавливают 0,5 г.

Перфузию проводят со скоростью

6 мл/мин при 24 С раствором следующего состава, в мМ: 1чаС! 120; КС14,8; CaClz 2,0;

М9С1 1,2; КН2Р04 1,2; 1чаНСОз 25; глюкоза

10. Раствор насыщают газовой смесью 95 ного Ог и 5 -ного COg, pH раствора после насыщения составляет 7,4 0,05, Мышца сокращается под влиянием злекрической стимуляции прямоугольными импульсами, величиной больше пороговой на 15-20 . длительностью 5 мс, с частотой

0,5 Гц. Длительность периода адаптации—

60 мин. В конце этого периода силу натяжения папиллярной мышцы увеличивают до развития максимальной силы сокращения и зту силу натяжения поддерживают до конца опыта.

После окончания периода адаптации в перфузионный раствор вводят изадрин в концентрации 3 10 М и зту концентрацию сохраняют до конца опыта. После стабилизации амплитуды силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые регистрируют. Затем в перфуэионный раствор добавляют кофеин в концентрации

6 10 М. После стабилизации силы сокращения и параметров ее первой производной эти кривые повторно регистрируют, Иэ документальных записей первой производной силы сокращения папиллярной мышцы морской свинки определяют максимальную скорость повышения силы сокращения последобавления в перфузионный раствор кофеина (4,2 r/с), максимальную скорость повышения силы сокращения до добавления в перфузионный раствор кофиена (5,4 r/c), их отношение (0,79), а также максимальную скорость расслабления после добавления в перфузионный раствор кофеина (9,8 r/), максимальную скорость расслабления до добавления в перфуэионный раствор кофеина (7,5 г/с), их отношение (р = 1,31).

В данном примере после добавления в перфузионный раствор кофеина прирост скорости напряжения меньше1.0,а скорости расслабления больше 1,0. Исходя из этих

40 результатов определяют положительный инотропный эффект добавления в перфуэионный раствор кофеина, связанный с увеличением входа кальция в миоплазму в ходе сердечного цикла через сарколемму при одновременном снижении его выброса из саркоплаэматического ретикулума.

Это заключение соответствует имеющимся представлениям о механизме действия кофеина, являющегося ингибитором фосфодиэстеразы и одновременно обедняющего саркоплазматический ретикулум кальцием.

Исходная кривая силы сокращения папиллярной мышцы имеет достаточно хорошо выраженную двухкомпонентную структуру, но под действием кофеина первый компонент исчезает, сердечный цикл заметно удлиняется, что делает невозможным использование кривой силы сокращения для определения механизма действия вещества на миокард по методике, изложенной в прототипе.

Применение предлагаемого способа позволяет (в отличие от способа-прототипа) определить механизм действия вещества на миокард за счет оценки влияния вещества на потоки кальция в миоплазму, ((Формула изобретения

Способ определения кардиотропной активности веществ путем регистрации сокращения капиллярной мышцы экспериментального животного до и после воздействия исследуемого вещества, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения информативности за счет оценки генеза активности, капиллярную мышцу извлекают, помещают в питательный раствор с температурой 24-26 С, в который добавляют

3 10 — 3 10 М изадрина, затем проводят стимуляцию мышцы с частотой 0,5 Гц и определение ведут по максимальной скорости повышения напряжения и расслабления мышцы, затем рассчитывают прирост скорости напряжения и прирост скорости расслабления мышцы отношением этих показателей, в случае если прирост скорости напряжения и расслабления мышцы больше единицы и в случае, если прирост скорости напряжения больше прироста скорости расслабления, определяют положительный инотропный эффект эа счет увеличения выброса кальция из саркоспаэматического ретикулуча,в случае, если прирост скорости напряжения меньше прироста скорости расслабления, определяют отрицательный анотропный эффект эа счет увеличения входа кальция через сарколему, если исследуемый показатель меньше

1,0 при приросте скорости напряжения

1635133

Составитель А.Бобров

Техред М.Моргентал Корректор Т.Малец

Редактор А.Ревин

Заказ 754 Тираж 413 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушскэя наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 больше прироста скорости расслабления за счет снижения входа кальция, если прирост скорости нап".яжения меньше прироста скорости расслабления за счет снижения выброса кальция из саркоплэзматического ретикулума, если прирост скорости нэпряжения меньше 1,0, э hpMpocT скорости расслабления больше 1.0 определяют положительный инотропный эффект вещества путем снижения выброса кальция из сар

5 коплазматического ретикулума и увеличения входа кальция через сарколемму.