Штамм бактерий аснrомовастеr agile - продуцент рестриктазы aag 525 i

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических исследованиях, в микробиологической промышленности. Целью изобретения является получение штамма, продуцирующего новую рестриктазу Аад 5251, обладающую более высоким выходом. Штамм-продуцент Achromobacter agile 525 выращивают на питательной среде , содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма Achromobacter agile 525 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Аад 5251, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК5 -AT CGAT -3 , в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы в биомассе 5-6 х 103 ед/г сырой биомассы. Для изошизомера Аад 5251 - рестриктазы Cla 1 выход очищенного фермента около 430 ед. на 1 г сырой биомассы. Выход очищенного фермента Аад 5251 составляет (1,7-1,9) х 10 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что более чем в 4 раза превышает выход известной рестриктазы Cla 1 (430 ед). Ј

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s»s С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Е (21) 4735705/13 (22) 12.07,89 (46) 15.05.91, Бюл. М 18 (71) Институт биологической и медицинской химии AMH СССР и Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) Н.Н.Соколов, И.И.Федор, А.Б.Фицнер, .

Н.В.Аникейчева, А.А.Калугин, О.Т.Самко, M.À.3ëьдвров и Э.Б.Хорошутина (53) 577.15 (088.8) (56) Mayer Н., Crosschedl R., Schutte Н..

Hobot G. С! а 1 а Нее re striction endonuclease

from CaryohatIon latum 1 . — Nucl. Acids Res., 1981, ч. 9, р. -4833-4845. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ACHROMOBACTER

AGILE — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ AAG

5251. (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических исследованиях., в микробиологической промышленности.

Целью изобретения является получение

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в экспериментальной работе в области молекулярно-генетических исследований, в микробиологической промышленности.

Цель. изобретения — получение штамма, продуцирующего новую рестриктаэу

Aag 5251, обладающую более высоким выходом.

Поиск штамма-продуцента проводили при помощи разработанного экспресс-метода тестирования активности в толуольных экстрактах микробных клеток с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агароэном геле.

„„5U „„1648976 А1 штамма, продуцирующего новую рестриктазу Aag 5251, обладающую более высоким выходом. Штамм-продуцент Achromobacter

agile 525 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из получ HHQA биомассы известными методами. Биомасса штамма Achromobacter agile 525 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Aag 5251, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДН К 5 —. А Т С G А Т вЂ” 3, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы в биомассе

5-6 х 10 ед/г сырой биомассы, Для изошиз зомера Aag 5251 — рестриктаэы Cia 1 выход очищенного фермента около 430 ед. на 1 r сырой биомассы. Выход очищенного фермента Aag 5251 составляет (1,7 — 1.,9) х 10 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что более чем в 4 раза превышает выход известной рестриктаэы Cia 1 (430 ед).

Штамм Achromobacter agile 525 получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов АН СССР, где хранится под М ВКМ-525

КМ МГУ (Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов).

Штамм Achromobacter agile 525 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.

Рестриктаза Aag 5251, изошиэомер Cia 1, узнает последовательность нуклеотидов А Т

С 6 А Т и расщепляет ДНК фага il, в 15 участках, Ad 2 в двух, pBR322 в одном и не

1648976

40

Культура типична для Achromobacter 45

50 гидролизует ДНК обезьяньего вируса SV 40 и ОХ 174, Эндонуклеаза рестрикции Aag 5251 является ценным инструментом для работ в области генетической инженерии. Фермент имеет один участок узнавания на наиболее распространенном в генетической инжене-. рии векторе для клонирования плазмиде рВ8322, причем сайт рестрикции локализуется в области гена. ответственного эа устойчивость к тетрациклину. Таким образом, клонирование ДНК в данном участке при помощи Aag 5251 в значительной степени облегчается возможностью проведения селекции рекомбинантов по фенотипу Тс (чувствительность к тетрациклину).

Характеристика штамма.

Морфологические свойства.

Палочки размером 0,7 х 2-4 мкм обычно расположены поодиночке, подвижны. грамотрицательны.

Культурально-биохимические свойства, -На скошенном агаре рост по штриху нежный. Колонии на чашке Петри с мясопептонным агаром мелкие, блестящие, края ровные. На мясопептонном бульоне на дне пробирки осадок, среда прозрачная.

Отношение к кислороду: строгий аэроб.

Желатина уколом — очень медленное разжижение.

Чувствительность к антибиотикам: культура чувствительности ко многим антибиотикам, резистентна к пенициллину, стрептомицину, полимиксину, Условия выращивания и хранения

Культура хорошо растет на твердых и жидких полноценных питательных средах: бульоне Хоттингера, среде 1 В. При культивировании на среде LB наблюдается продолжительная лаг-фаза..Оптимум роста при,37 С. Зона рН роста культуры лежит в пределах 4,6-9;5. Оптимум роста культуры и образования фермента при рН среды

7,2 — 7,4, При рН 10 0 культура не растет, agile.

Наибольший выход биомассы, содержащей эндонуклеазу рестрикции Aag 5251, получают в том случае, когда штамм-продуцент выращивают на питательной среде

Хоттингера, которая содержит в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера, 5 г NaCI, 1 r K2HP04, до 1 л воды.

Выделение рестриктазы проводят фракционированием и хроматографией на колонках.

Пример 1. Культуру Achromobaeter

agile, штамм 525 предварительно адаптируют на питательной среде, содержащей в

1 л 250 мл основного перевара Хоттингера, 10

5 г NaCI, 1 r К2НР04, до 1 л воды, при 37 С в течение ночи. Инокулят для ферментера готовят, паресевая адаптированную культуру на

1 л свежей среды иэ расчета 1:10, и размножают в условиях аэрации.

Ферментацию культуры проводят после добавления в среду инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при 37 С в условиях аэрации. рН среды 7,2-7,4.

Во время выращивания рН культуральной жидкости поддерживают, в пределах 7,4—

7,6.

Выращивание продолжают до фазы замедления роста.

Выход биомассы 5 г/л культуральной жидкости.

Содержание рестриктазы Aag 5251

6000 ед/г биомассы.

Определение активности фермента проводят экспресс-методом в толуольных экстрактах бактериальных клеток с последующим электрофорезом в агарозном геле продуктов расщепления ДНК, Выделение эндонуклеаэы рестрикции

Aag 5251.

5 г биомассы Achromobacter agile 525 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при 2 — 40C. После удаления остатков клеточных оболочек. и неразрушенных клеток фермент фракционируют 1 g -ным полиэтилен ими ном, а затем в двухфазной системе полиэтиленгликоль— декстран. Обогащенный рестриктазой экстракт хроматографируют в калийфосфатном буфере в градиенте КС1 на колонках с

ДЭАЭ-целлюлозой (ДЕ-52), затем. на колонках с гепаринсефарозой и голубой сефарозой (фирмы "Фармация" );

Получают 8,5 х 10 ед. фермента в 2,5 мл . глицеринового буфера. Препарат фермента стабильно сохраняет активность в течение

12 мес. Выход очищенного препарата рестриктазы Aag 5251 составляет 1,7 х 10 ед. на 1 г сырого веса биомассы.

Рестриктаэа пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования, Пример 2. Культивирование штамма

А. agile 525 проводят аналогично описанно-. му в примере 1 за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду l8, которая содержит в 1 л 10 r триптона, 10 г дрожжевого экстракта, 10 r NaCl и до 1 л воды.

Выход биомассы 4 г/л культуральной жидкости.

После проведения очистки фермента, как описано выше, выход рестриктазы Aag

5251 1,9 х 10 ед/г биомассы.

1648976 а держание рестриктазы в биомассе

5000-6000 ед. на 1 r сырой биомассы.

Для изошизомера Aag 5251 — рестриктазы С!а 1 выход очищенного фермента около

5 430 ед. на 1 r сырого веса биомассы.

Выход очищенного фермента Аад 5251 (1,7-1 9) х 10 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что более чем в 4 раза превышает известные цифры для Cla 1 (430 ед).

10 Формула изобретения

Штамм бактерий Achromobacter agile

ВКМ В-525 — продуцент рестриктазы

Aag 5251, Таким образом, по предлагаемому способу получают новую эндонуклеазу рестрикции Aag 5251.

Поиск новой рестриктазы проводился путем скрининга у 150 штаммов различных видов бактерий.

Биомасса штамма А. agile 525 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Аао 5251, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 — А Т1С G А Т, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: со15

Составитель И. Привалова

Редактор Л. Веселовская Техред M.Mîðãåíòàë Корректор M. Шароши

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Заказ 1499 Тираж 380 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5