Способ диагностики хронической внутриутробной гипоксии плода

 

Изобретение относится к медицине , в частности к клинической перипатологии, и может быть использовано для диагностики внутриутробной гипоксии плода. С целью повышения точности и ускорения способа определяют значения активности супероксиддисмутазы в эритроцитах рожениц до наступления родов, рассчитывают их на 1 мг к 1 г гемоглобина соответственно и при одновременном снижении этих показателей относительно нормы диагностируют хроническую внутриутробную гипоксию плода. Применение способа позволит сократить время постановки диагноза в 2 раза и повысить точность определения до 95%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s)) 5 Г:)1 N 33/68

b!rl 5 „, y! .

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЬГГИЛМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4185233/14 (22) 20. 01.87 (46) 23. 05. 91. Бюл. ¹ 19 (71) Ленинградский педиатрический медицинский институт (72) Е.Е.Дубинина, Л.Н.Софронова, Л.Ф.Ефимова и Л.А.Сальникова (53) 616.07(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹- 1142103, кл. А 61 В 10/00, 1985. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОЙ1

ВНУТРИУТРОБНОЙ ГИПОКСИИ ПЛОДА (5/) Изобретение относится к медицине, в частности к клинической пери— натологии, и может быть использоваИзобретение относится к области медицины, в частности к клинической перинатологии, и может быть использовано для диагностики хронической внутриутробной гипоксик плода.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

У рожениц до родов берут 1 мп крови на исследование активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Эритроциты отделяют от плазмы и промывают 3-4 раза изотоническим раствором при повторном центрифугировании в течение 15 мин при

6000 g и 4 С.

Отмытые эритроциты гемолизируют трис-НС1 5 MM (рН 7,4) в соотношении 1:10. В гемолизате определяют активность СОД и каталазы. Для этоHо для диагностики внутриутробной гнпоксии плода, С целью повышения точности и ускорения способа определяют значения активности супероксиддисмутазы в эритроцитах рожениц до наступления родов, рассчитывают их на 1 мг и 1 г гемоглобина соответственно и при одновременном снивЂ,,ении этих показателей относительно нормы диагностируют хроническую внутриутробную гипоксию плода. Применение способа позволит сократить время постановки диагноза в 2 ра— за и говысить точность опредсления до 957. го с целью осаждения гемоглобина„ который снижает точность в определении активности СОД, к части гемолизата добавляют этанол (95 ) и хлороо форм в соотношении соответственно

1:0,25:0,15.

В процессе перемешивания смеси в течение 15 мин гемоглобин выпадает в осадок, который отделяют путем центрифугирования при 12000 Р и

40С в течение 15 мин. Активность определяют в бесцветной надосадочной жидкости.

Вторую часть гемолизата разводят в 2000 раз бидистиллированной водой и затем определяют активность каталазы., Третью часть гемолизата в количестве 0,1 мл используют для определения содержания гемоглобина. Для этого к гемолизату приливают 4,9 и1651215

0,024 н. раствора аммиака и степень интенсивности окраски измеряют на спектрсхЬотометре при длине волны

540 нм.

Об активности СОД судят по снижению скорости процесса восстановления нитросинего тетрязолия в присутствии НАДН2 и феназинметасульфата.

Состав инкубационной смеси: мкм 10

ЕДТА, 1 мг желатины, 0.,407 мм нитросинего тетразолия, 1,8 мкм феназинметасульфата и 0,1 мл 1 мМ раствора НАДН2. Обп нй объем доводится до 3 мл фосфатным буфе- 15 ром 0,07 М (рН 7,8). В контрольной пробе определяют степень восстановления нитросинего тетразолия после инкубации в течение 10 мин при 2022 С в темноте и в аэробных условиях.

В опытной пробе после добавления в инi óáàöèîíHóþ смесь 0,04-0,,06 мп надосадочной жидкости определяют в тех же условиях степень снижения процесса восстановления нитросинего тетразолия.25

Линейная зависимость между объемом добавленной надосадочной жидкости и скоростью ферментативной реакции наблюдалась при торможении процесса восстановления нитросинего тетразолия 30 от 25 до 75ь. Измерение степени окраски опытной и контрольной проб проводили на спектрофотометре при длине волны 540 нм.

Степень ингибирования определяют и:o формуле

LV.-EQ

Т=- — — 1009

Е где Т вЂ” процент ингибирования процесса восстановления нитро40 синего тетразолия;

Š— оптическая плотность раство К ра контрольной пробы;

Š— оптическая плотность раствоо ра опытнон группы °

Активность СОД выражают в условных единицах. 503 ингибирования процесса восстановления нитросинего тетразолия по сравнению с контрольной пробой принято считать одной условной

50 единицей

Т

А= — ——

100-Т где А — количество условных единиц активности фермента в опытной пробе;

Т вЂ” процент ингибирования процесса восстановления нитросинего тетразолия СОД.

Трис-НС1-ЭДТАбуферный раствор (рН 8,0)

Раствор H20g (10 ммоль)

Вода бидистиллированная

Гемолизят в

0,05

0,05

0,90

Оь93

0,03 разведении

1:2000 0,02 0,02

Снижение оптической плотности в опытной пробе измеряли против контроля каждые 30 с в течение 3 мин при комнатной температуре на СФ-16 (дгп на волны 230 нм)

Скорость реакции линейная в первые 3-4 мин. При расчете активности каталазы использовали среднее значение изменения оптической плотности пробы за каждую минуту в течение

3 мин . ре-Е 1)+ (Ел-Е )+(Е -E ) - С

3 где Е начальный показатель от счета;

Активность фермента выражают в условных единицах, отнесенных либо на мг гемоглобина, либо на 1 мп эритроцитарной суспензии с учетом разведения гемолизата по формулам

0 02667 А 0 14 А

А, =-- — — — —; А

E 1 2 где А — активность фермента, усл.ед./мг гемоглобина;

А — активность фермента, усл. ед. /мл эритроцитов;

V — объем добавленного супернатанта;

Е н — оптическая плотность гемоглобина в растворе гемолизатя;

0,14 — постоянный коэффициент разведения гемолизата;

3,02667 — постоянный коэффициент, выведенный с учетом разведеHHR гемолизята и постоянного коэффициента экстинции (190,5) 1 г гемоглобина в кювете 3 см при длине волны

540 нм.

Об активности каталазы в гемолизате эритроцитов судили по убью Н О2 в тканях eà 1 мин при длине волны

230 нм, Состав инкубационной смеси, мл:

Контроль- Опытная няя проба проба

6 (ПОЛ) у матери своевременно диагностировали внутриутробную хроническую гипоксию плода по обнаруженному снижению активности ферментов. Последующие наблюдения подтвердили диагноз гипоксии плода. Новорожденный ребенок родился в состоянии асфиксии с оценкой по шкале Апгар 6/8 (патологии родового акта не отмечено). Активность ферментов в пуповинной крови также низкая — 0,93 усл.ед./мг геМоглобина для СОД и 7,00 10 межд.ед./r гемоглобина для каталазы. В первые дни состояние ребенка средней тяжести„ к груди приложен на 4 день, отмечалась типичная патологическая неврологическая симптоматика, возникающая у детей, перенесших длительную внутриутробную гикопсию. Таким образом, нормальные показатели ПОЛ в этом случае не позволили установить диагноз внутриутробной хронической гипоксии плода. Изменения активности СОД и каталазы эритроцитов точно отражали состояние плода и новорожценного.

Пример 2. Мать К. и ее новорожденный. Из анамнеза известно, что беременность у матери протекала благоприятно ° В родах развилась первичная слабость родовой деятельности, проводилась родостимуляция. В эритроцнтах матери выявлено повышение скорости

ПОЛ, при этом величина активности СОД

1,79 усл. ед./мг гемоглобина и величина активности каталазы 21,0 10 мерц,ед./г гемоглобина соответ. ф ствовали нормальным показателям. Ребенок родился в удовлетворительном состоянии, с оценкой по шкале Artrap 9/10, в первые сутки приложен к груди. При дальнейшем наблюдении состояние оставалось вполне удовлетворительным, и на 6 день жизни он выписан из родильного дома домой. Активность СОД и каталазы в пуповинной крови не отличались от контрольной группы (1 28 усл. ед./мг гемоглобина и 12 0> х104 межц,ед./г гемоглобина, соответственно). Нормальный уровень активности антиокислительных ферментов характеризовал удовлетворительное состояние плода и новорожденного, в то время, как ускорение процессов ПОЛ не отражало истинного его состояния.

16512

10 коэффициент пересчета

490 5 10 (— - — — — ), складывающийся

0,071 У из учета разведения эритроцитов, молярного коэффициента экстинкции (190,5) г гемоглобина в кювете 3 смз при длине волны 540 нм и коэффициенте молярнои экстинкции 35

Н О (0,071).

При одновременном снижении активности СОД и каталазы в эритроцитах крови матери диагностируют хроническую внутриутробную гипоксию плода <О (уровень активности ферментов СОД и каталазы в эритроцитах у здоровых беременных соответственно 1,78 усл.ед./мг гемоглобина и 19 14м

Ф

Ф 10 межд.ед. /г гемоглобина. 45

Пример 1. Мать Б. и ее новорожденный. У матери по данным анамнеза с 30 недель беременности развился поздний токсикоз. Скорость перекис- ного окисления липидов (по уровню диенкетонов и конъюгированных диенов) в эритроцитах не превышала величин в контрольной группе женщин. Активность

СОД и каталазы была снижена (0,92 усл.ед./мг гемоглобина и 13, 1к, 55 с10 межд.ед./г гемоглобина соответственно). Несмотря на нормальные вели,чины перекисного окисления липидов

Е.„, Е.

Š— оптические плотности пробы

Э через 1,2,и 3 ми н с начала измерения.

Активность фермента выражали в международных единицах по количеству разрушенного субстрата в ммолях и относили к количеству эритроцитарной взвеси в миллилитрах гемоглобина в граммах:

E м

А= — -—

0,071 где А — количество ммоль Н О, разрушенной в среднем за 1 мин при взаимодействии с 0,02 мл гемолизата;

0,071 — коэффициент молярной экстинкции Налог °

Е cg ° 10 268 3 Е со ° 10

А

1 ОЛ071 2 Е М где А — активность каталазы, межд. ед./мл эритроцитарной взвеси;

A> — активность каталазы, межц.ед./г гемоглобина;

268 ю 3 > 10+

Применение способа в медицинской практике позволит сократить время ди1651215 шийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, в эритроцитах крови рожениц опредепяют содержание супероксиддисмутазы и каталазы и при одновременном снижении этих показателей относительно нормы диагностируют хроническую внутриутробьую гипоксию плода. агностики в 2 раза и диагностировать хроническую внутриутробную гипоксию плода с точностью до 95 .

Формул а изобретения

Способ диагностики хронической внутриутробной гипоксии плода путем исследования крови, о т л и ч а ю—

Составитель Ч.Ванеева

Редактор Н.Бобкова Техред М.Моргентал Корректор М.Самборская

Заказ 1604 Тираж 419 Подписное

ВШЫН1 Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производствсн ю-изаатея вский комбинат Ii,зтент", г .Ужгород„ ул . Гагарина, 101