Способ количественного определения активности каталазы

 

Изобретение относится к медицине и биохимии и может быть широко использовано в клинической медицине и диагностике для тестирования функциональной активности фагоцитов периферической крови человека при определении иммунного статуса организма. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Для определения активности каталазы используют пероксидгенерирующую систему, состоящую из глюкозы и глюкозооксидазы, и пероксидрегистрирующуюсистему, состоящую из люминола и пероксидазы. Образующиеся в ходе пероксидазной реакции кванты света регистрируют при помощи люминометра или сцинтилляционного счетчика . В присутствии каталазы снижается стационарная концентрация пероксида, причем снижение пропорционально активности каталазы. Чувствительность способа 0,42 - 0,65 ед.активности в пробе. 4 фиг. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 Q 1/26

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

"I и (21) 4666439/13 (22) 24,03.89 (46) 15.06.91. Бюл.№22 (71) Ленинградский государственный университет (72) А.А.Токмаков и О.Е.Благова (53) 577,15.08 (088.8) (56) Gnllbault G.G, Handbook of Enzymatic

methods of analysis, 1976, Marcel Dekker, New York.

Патент США ¹ 3926732, кл. С 12 Q 1/26, 1974. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ . (57) Изобретение относится к медицине и биохимии и может быть широко использовано в клинической медицине и диагностике для тестирования. функциональной активноИзобретение относится к медицине и биохимии, в частности может быть широко использовано в клинической медицине и диагностике для тестирования функциональной активности фагоцитов периферической крови человека при определении иммунного статуса организма, Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Способ заключается в том, что инкубацию каталазы осуществляют с ферментативной пероксидгенерирующей системой, которая содержит глюкозу в количестве 3—

40 мкг; в пероксидгенерирующую систему (глюкозооксидазную систему — ГОС) добавляют в качестве индикаторного вещества люминол в насыщающей концентрации 5 . 10 М, определяют величины хемилюминесценции эталонных проб, по которым строят калибровочную,, БЫ„, 1655990 А1 сти фагоцитов периферической крови человека при определении иммунного статуса организма. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Для определения активности каталазы используют пероксидгенерирующую систему, состоящую из глюкозы и глюкозооксидазы, и пероксидрегистрирующую систему, состоящую из люминола и пероксидазы. Образующиеся в ходе пероксидазной реакции кванты света регистрируют при помощи люминометра или сцинтилляционного счетчика. В присутствии каталазы снижается стационарная концентрация пероксида, причем снижение пропорционально активности каталаэы. Чувствительность способа

0,42 — 0,65 ед.активности в пробе, 4 фиг, кривую зависимости величины хемилюминесценции от активности каталазы в эталонных пробах, после чего измеряют хемилюминесценцию искомой пробы и по калибровочной кривой эталонных проб определяют активность каталазы. Способ заключаетсяя в использовании пероксидгенерирующей ферментативной системы ГОС и в регистрации люминолзависимой хемилюминесценции, уменьшение значений которой характеризует разложение перекиси водорода каталазой. В используемой биферментной системе происходят следующие реакции: 1) пероксидгенерирующая система (глюкозооксидазная система) в присутствии л юминола: глюкоза+ HzOz++Oz глюкозооксидаза глюконат+ HzOz

2) Н20а к аюмииоа пероксидааа аминофталат+ НгО+ Nz.

1655990

25

Образующиеся в ходе реакции кванты света регистрируются при помощи люминометра или сцинтилляционного счетчика.

Люминол (5-амино-2,3-дигидрофталазиндион) при окислении пероксидом в водных основных растворах дает яркую хемилюминесценцию, Структурная формула люминола приведена ниже;

ОН

СООН 1

О i О

NH С00Н

ИН2 О NH2 О, ИН2 люминол диазохинон аминофталат (конечный продукт реакции)

Показано, что в процессе его окисления образуются такие продукты, как диазохинон и 3-аминофталевая кислота. Последняя является конечным продуктом окисления.

По-видимому, 3-аминофталат является эмиттером света.

При добавлении к пероксидгенерирующей системе с люминолом каталазы эффективная концентрация (HzOz) снижается в результате ферментной реакции; 3) Н202 каталаза НгО2+ Oz.

Это вызывает снижение квантового выхода в реакции (2) и, следовательно, уменьшение величины хемилюминесценции, Таким образом, уменьшение величины хемилюминесценции системы 1.+2. при добавлении каталазы за определенный интервал времени соответствует количеству перекиси водорода, разложенного каталазой эа данный интервал времени.

На фиг,1 представлены кривые кинетики хемилюминесценции пероксидгенерирующей системы с люминолом в отсутствие и в присутствие каталазы представлены. Во всех случаях инкубационная смесь содержит 0,5 мл раствора ГОС, 40 мкг глюкозы, Конечный объем проб 0,6 мл, Кривая 1 соответствует кинетике хемилюминесценции в отсутствие каталазы, а кривые 2 — 6 — в присутствии каталазы соответственно с активностью 3,9; 3,9х2; 3,9х4; 3,9х8;

3,9х16 ед,активности фермента.

На фиг.2 представлена кривая зависимости величины максимальной интенсивности хемилюминесценции от концентрации каталаэы в пробе. п макс

Отношение - близко к 1, что сви1nС детельствует в пользу первого порядка каталээной реакции.

Данная кривая построена на основе кривых фиг.1, т.е. при концентрации глюкозы в системе, равной 40 мкг. Средний участок кривой 2 соответствует значениям активности каталазы 0,78х4 0,78х70 ед. ферментативной активности (т.е. диапазон измеряемых активностей каталазы около 1 порядка). Причем возможность оп ределения предельно низкой активности фермента достигается использованием в пероксидгенерирующей системе глюкозы в количестве

3 мкг, в то время как стандартная система

ГОС содержит 40 мкг, Кривая зависимости величины хемилюминесценции (;(,) от активности каталаэы, вносимой в пробу (фиг.3), построена при концентрации глюкозы в системе 3 мкг/пробу. Активность каталазы

0,42 — 0,65 ед, активности дает снижение величины хемилюминесценции íà 10%, что является достбверным изменением и может служить нижней границвй оценки чувствительности данного метода, Использование глюкозы в концентрации ниже 3 мкг на пробу невозможно для данного метода, так как для построения калибровочной кривой зависимости хемилюминесценции от активности каталазы необходим диапазон изменений интенсивности (величины) хемилюминесценции как минимум на 1 порядок, а именно, использование 3 мкг глюкозы s пробе позволяет получить уровень хемилюминесценции, превышающий фоновый на порядок.

С другой стороны, концентрация глюкозы 40 мкг на пробу является верхним предельным значением, позволяющим сохранить высокую чувствительность метода, так как при повышении концентрации глюкозы 40 мкг возрастает интенсивность хемилюминесценции и активность каталазы, способная эаингибировать реакцию и снизить хемилюминесценцию, возрастает до значений не менее 2 — 3 ед. активности.

На фиг.4 представлена кривая зависимости интенсивности хемил юминесценции от концентрации люминала в инкубационной среде.

Реакция протекает в условиях насыщения по люминолу, что следует иэ графика зависимости интенсивности люминесценции от концентрации люминола s инкубационной среде (концентрация глюкозы в пероксидгенерирующей системе неизменна — 40 мкг ). Квантовый выход реакции достигает максимума при концентрации люминола 2 — 5х10 М и остается неизменным

-5 при дальнейшем ее увеличении. Таким образом, рабочей концентрацией выбрана

5,10 M. Использование более высоких концентраций люминола не приводит к,улучше1655990 нию условий протекания реакции, однако сопровождается повышенным расходом дефицитного компонента инкубационной среды.

Пример. В качестве эталонной используют каталазу фирмы "Serva" вв 2ИЮО из печени быка с удельной активностыс

39000 ед./мг, Суспенэию фермента в воде. насыщенной тимолом, 20 мг/мл предварительно разбавляют в 1000 разф мкл-0,78ед. активности). В качестве искомой используют каталазу фирмы "Реахим" из печени крупного рогатого скота марки "Б" с предполагаемой удельной активностью 41650 ед./мг.

Глюкозооксидазную систему ГОС составляют по Ллойду. Проба содержит 3 или

40. мкг глюкозы. Концентрация люминола— насыщающая 5 10 М. Конечный объем пробы 0,6 мл. Каталазу вносят в объеме

100 мкл. Конечное объемное соотношение компонентов в смеси — проба. ферментативная система: индикаторное вещество—

0,5;1 О.:0,05.

Во всех случаях инкубационная смесь содержит 0,5 мл раствора ГО С. Инкубационную смесь, содержащую все компоненты, . включая каталвзу. прединкубируют в темноте в течение 1,5 мин, чтобы исключить эндогенный пероксид. Реакцию инициируют добавлением глюкозы. Измеряют хемилюминесценцию эталонных проб в течение 10 — 12 мин на жидкостном сцинтилляциониом счетчике "Б ЕТА-1", термостатиро ванном при 37 С, и получают кинетические кривые хемилюминесценции для эталонных проб.

На основе полученных кривых кинетики изменения величины хемилюминесценции эталонных проб в отсутствие и в присутствие каталазы (фиг.1) строят калибровочную кривую зависимости максимальной величины (интенсивности) хемилюминесценции от активности каталазы в пробе.(фиг.2,3).

Затем аналогичным образом получают кинетические кривые хемилюминесценции

5 для искомой пробы, в двух разведениях.

Каталазу "Реахим" с предполагаемой активностью 41650 ед./мг разводят до получения предполагаемых концентраций 80 и

160 ед., а именно каталаэу разводят до пол10 учения расчетной:концентрзции 40 ед/мг и далее берут по 2 и 4 мкл.

По графику калибровки оказалось. что внесение в пробу 2 мкл суспензии кзтвлазы с искомой активностью дает максимальную

15 величину хемилюминесценции иа пределе чувствительности, что соответствует 2,7 ед. активности, а 4 мкл соответствует 5 5 ед. активности, т.е, активность квталазы "Реахим" упала в 30 раз по .срзвнению с марки20 ровочными данными, т,е. удельная

2,7ед активность искомого препарата x

2мкл

1000-1350 ед./мг вместо мвркировочных

41650 ед,/мг.

Формула изобретения

Способ количественного определения активности каталазы, включающий инкубацию анализируемого образца в ггрисутствии

30 пероксидгенерирующей системы, состоящей иэ глюкозооксидазы и утлеводного субстрата, и пероксид регистрирующей системы, состоящей из пероксидазы и субстрата пероксидазы, о т л ич е ю щи и с я

35 тем, что, с целью повышения чуествител ьности способа, в качестве углеводного субстрата глюкозооксидазы используют глюкозу в количестве 3 — 40 мкг, а в качестве .субстрата пероксидазы — люминол в кон40 центрации 5 10 М, 1655990 б 8 70 12

1 2 3 4 9 улы

Фыг. 2

1655990

ГО Е )ед

Редактор Т, Лазоренко

Заказ 2030 Тираж 368 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035,-Москва, Ж-35. Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

%z/и по

Eg Хммс

15 аг5

Составитель Т. Семенов

Техред М.Моргентал Корректор И. Муска