Способ выявления антитоксических свойств биологически активных веществ

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в фармакологии и фармацеи. Способ включает воздействие исследуемого вещества на цитохром Р-450 и на глутатионтрасферазу, определяют скорость ферментативной реакции до и после воздействия. Результат оценивают по соотношению скоростей ферментативных реакций после и до воздействия исследуемого вещества, при соотношении, большем 1, делают заключение о наличии антитоксических свойств, а при соотношении, равном или меньшем 1, делают заключение об отсутствии антитоксических свойств. Повышается информативность способа, позволяющего проводить in vitro скрининг БАВ, обладающих антитоксическими свойствами. Способ обладает высокой специфичностью, чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, меньшей трудоемкостью. 4 табл.

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии и фармации.

Разработка современных эффективных экспресс-методов выявления биологически активных веществ (БАВ) антитоксического действия является актуальной в связи с необходимостью сокращения сроков проведения исследований, позволяющих обнаружить антитоксиканты среди веществ, обладающих различной биологической активностью. Эта задача может быть решена путем разработки молекулярных тест-систем с использованием ферментов в качестве тест-объектов.

Антитоксическую активность оценивают на различных моделях с использованием в качестве тест-объектов подопытных животных, культур клеток гепатоцитов. [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва, 2005, стр.684].

Известны физиологические способы выявления веществ, обладающих антитоксической активностью. К ним относятся - определение продолжительности гексеналового сна лабораторных животных (гексеналовая проба) и проба с бромсульфолеином. Первый способ позволяет оценить антитоксическое действие веществ по сокращению продолжительности сна, вызванного гексеналом, который вводится мышам (80 мг/кг внутрибрюшинно) или крысам (60 мг/кг внутрибрюшинно). Продолжительность гексеналового сна определяется скоростью метаболизма гексенала, осуществляемого цитохром Р-450 - зависимой монооксигеназной системой гепатоцитов [Там же, стр.685]. Второй способ - проба с бромсульфалеином состоит в определении содержания бромсульфолеина в крови крыс через 1, 5, 15 и 45 минут после введения красителя (1-5 мг/кг) в хвостовую вену и вычислении коэффициента ретенции бромсульфалеина, выделяемого в виде коньюгатов с цистеином и глутатионом [Там же, стр.685].

Известен способ исследования антигепатотоксического эффекта веществ, на культуре изолированных гепатоцитов. Для этого в среду инкубации гепатоцитов помещают растворимые в воде исследуемые вещества, а также гепатотоксины (четыреххлористый углерод, парацетамол, Д-галактозамин, аллиловый спирт, гидразин или акролеин) и исследуют показатели жизнеспособности и морфологию клеток, биотрансформацию в них ксенобиотиков [Там же, стр.687].

Наиболее близким является способ выявления веществ, обладающих антитоксическими свойствами, заключающийся в использовании тест-объектов, например цитохром Р-450 [Арчаков А.И. Оксигеназы биологических мембран, М., Наука, 1983]. Способ заключается в выявлении индукторов или ингибиторов метаболизма ксенобиотиков у интактных животных или у животных с поврежденной антитоксической функцией при интоксикации четыреххлористым углеродом, аллиловым спиртом или D-галактозамином. Для этого в изолированной из печени микросомальной фракции определяют содержание РНК, белка и цитохромов, кроме того, определяют активность N-деметилазы амидопирина (субстрата 1 типа) и n-гидроксилазы анилина (субстрат 2 типа), характеризующих ферментиндуцирующее действие веществ на цитохром Р-450-зависимую монооксигеназную систему при системном введении лабораторным животным.

Недостатками данных способов являются большая трудоемкость, необходимость использования большого количества лабораторных животных, длительность эксперимента, что значительно увеличивает время проведения первичного скрининга и экономические затраты.

Технический результат данного изобретения заключается в

- повышении информативности способа выявления веществ, обладающих антитоксическими свойствами за счет последовательного использования ключевых ферментов системы биотрансформации и детоксикации токсических веществ цитохрома Р-450 и глутатионтрансферазы,

- создании молекулярной специфической системы, позволяющей проводить in vitro скрининг БАВ, обладающих антитоксическими свойствами,

- создание способа, обладающего высокой специфичностью, чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, информативностью, меньшей трудоемкостью, чем известные способы.

Поставленная цель достигается путем использования способа выявления антитоксических свойств биологически активных веществ, заключающегося в воздействии исследуемого вещества на цитохром Р-450, определении скорости ферментативной реакции и оценке полученного результата. При этом исследуемым веществом дополнительно воздействуют на глутатионтрансферазу, определяют скорость ферментативной реакции до и после воздействия, а оценку результатов проводят по соотношению скоростей ферментативных реакций после и до воздействия исследуемого вещества, при соотношении, большем 1, делают заключение о наличии антитоксических свойств, а при соотношении, равном или меньшем 1, делают заключение об отсутствии антитоксических свойств.

Технический результат данного изобретения, заключающийся в повышении информативности способа выявления веществ, обладающих антитоксическими свойствами достигается за счет последовательного использования ключевых ферментов системы биотрансформации и детоксикации токсических веществ цитохрома Р-450 и глутатионтрансферазы, а именно:

1. Фермент цитохром Р-450 (далее - цит.Р-450, ЕС 1.14.14.1) катализирует комплекс монооксигеназных реакций гидроксилирования ксенобиотиков и экзогенных гидрофобных соединений, в том числе ядовитых и токсических веществ, на 1-м этапе биотрансформации.

2. Фермент глутатионтрансфераза (далее ГТФ, ЕС 2.5.1.18) катализирует конъюгацию электрофильных токсических соединений метаболизма веществ, образующихся в монооксигеназной системе цитохрома Р-450, с восстановленным глутатионом на 2-м этапе биотрансформации, детоксицируя их.

Для доказательства специфичности заявленного способа выявления биологически активных веществ, обладающих антитоксическими свойствами, in vitro с применением заявляемых ферментов, были изучены фармакологические препараты и экстракты лекарственных растений, содержащих вещества:

- с установленными антитоксическими свойствами;

- относящиеся к другим фармакологическим группам и не обладающие искомыми свойствами;

- с неизвестной биологической активностью.

Предлагаемый способ иллюстрируется примерами 1-4.

В представленных примерах скорости реакций, катализируемых заявленными ферментами, определяли спектрофотометрически, in vitro, используя суспензию микросом, полученную известным методом [Куразина И.И., Бачманова Г.И. и др. - Биохимия, 1979, т.44, с.1049-1057] из печени крыс. Измерения проводили в кинетическом режиме. Скорость монооксигеназных реакций n-гидроксилирования анилина и N-деметилирования диметиланилина (ДМА), катализируемых цитохромом Р-450, определяли в 1 см кювете при 37°С при длине волны 340 нм по убыли НАДФН (никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный) при окислении в процессе реакции [Azehakov A., Kazuzina J.J., Kokareva J.S., Bachmanova G.J. - 1973 - Biochem. J. - v.136. p.371-379]. Концентрация НАДФН составляла 0,3 мМ, анилина и ДМА - 3 мМ, микросом 1 мг/мл. Скорость коньюгации 2,4-динитрохлорбензола (ДНХБ) с восстановленным глутатионом (GSH) в системе ГТФ определяли в 1 см кювете при 27°С по нарастанию поглощения при 340 нм вследствие образования продукта коньюгации ДНХБ и GSH по методу [Habig W.H., Pabst M.Y., Jakoby W.B., 1974. J.Biol. Chem. v.249. h.7130-7139]. Концентрация ДНХБ составляла 0,7 мМ, GSH-1мМ. Измеряли скорость ферментативной реакции без добавления изучаемого вещества (контроль) и после добавления изучаемого вещества (опыт) в конечных концентрациях 2×10^-3-2×10^-6 мг/мл. В таблицах приводятся средние арифметические значения из 3 определений и стандартные отклонения среднего результата (М±m). В примере приведены результаты, полученные при оптимальных концентрациях вещества в пробе.

ПРИМЕР 1. Влияние веществ, обладающих антитоксическими свойствами, на скорости ферментативных реакций, катализируемых цитохромом Р-450 и глютатионтрансферазой, in vitro.

Скорости реакций, катализируемых заявленными ферментами, определяли спектрофотометрически, in vitro, используя суспензию микросом, полученную известным методом [Куразина И.И., Бачманова Г.И. и др. - Биохимия, 1979, т.44, с.1049-1057] из печени крыс. Измерения проводили в кинетическом режиме. Скорость монооксигеназных реакций n-гидроксилирования анилина и N-деметилирования диметиланилина (ДМА), катализируемых цитохромом P-450, определяли в 1 см кювете при 37°С при длине волны 340 нм по убыли НАДФН (никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный) при окислении в процессе реакции [Azehakov A., Kazuzina J.J., Kokareva J.S., Bachmanova G.J. - 1973 - Biochem. J. - v.136. p.371-379]. Концентрация НАДФН составляла 0,3 мМ, анилина и ДМА - 3 мМ, микросом 1 мг/мл. Скорость коньюгации 2,4-динитрохлорбензола (ДНХБ) с восстановленным глутатионом (GSH) в системе ГТФ определяли в 1 см кювете при 27°С по нарастанию поглощения при 340 нм вследствие образования продукта коньюгации ДНХБ и GSH по методу [Habig W.H., Pabst M.Y., Jakoby W.B., 1974. J.Biol. Chem. v.249. h.7139-7139]. Концентрация ДНХБ составляла 0,7 мМ, GSH-1мМ. Измеряли скорость ферментативной реакции без добавления изучаемого вещества (контроль) и после добавления изучаемого вещества (опыт) в конечных концентрациях 2×10^-3-2×10^-6 мг/мл. В таблице 1 приводятся средние арифметические значения из 3 определений и стандартные отклонения среднего результата (М±m). В примере приведены результаты, полученные при оптимальных концентрациях вещества в пробе.

Изучали влияние на ферментативную активность заявленных ферментов эталонного фармпрепарата - Карсила [Машковский М.Д. Лекарственные средства, М., 2000] и его аналога Силимара [Энциклопедия лекарственных средств, изд.6, 1999], содержащих действующие флавоноиды-флаволигнаны группы силимарина, полученных из плодов расторопши пятнистой, а также Сибектана, являющегося комплексным препаратом, состоящим из субстанций силимара и танацехола, экстракта травы зверобоя (действующие флавоноиды-гиперазид, рутин), экстракта листьев березы.

Установлено, что вещества с антитоксическими свойствами, входящие в состав Карсила и Силимара, увеличивают скорости ферментативных реакций, катализируемых заявленными ферментами в условиях, in vitro. Как видно из данных таблицы 1, в присутствии Карсила и Силимара повышается скорость n-гидроксилирования анилина в монооксигеназной системе цитохрома P-450, а на тест-объекте, глютатионтрансферазе - скорость реакции коньюгации ДНХБ с GSH. Из результатов, представленных в таблице 1, видно, что соотношение скорости ферментативных реакций после и до добавления Карсила или Силимара больше 1.

На заявленных ферментах установлено, что БАВ, содержащиеся в Сибектане (известный гепатопротектор с известными антитоксическими и желчегонными свойствами), взаимодействуя с ферментными системами, in vitro, увеличивают скорости катализируемых ими ферментативных реакций. Из данных таблицы 1 видно, что скорость ГТФ реакции, скорости гидроксилирования анилина и деметилирования ДМА, катализируемые цитохромом Р-450, после и до добавления Сибектана больше 1, что доказывает специфичность и высокую чувствительность заявляемого способа.

ПРИМЕР 2. Влияние веществ, не обладающих антитоксическими свойствами, на скорости реакций, катализируемых цитохромом Р-450 и глютатионтрансферазой, in vitro.

Скорость реакций заявленных ферментов определяли как в примере 1.

Использовали антимикробные препараты Санвиритрин (действующие БАВ - суммы бисульфатов алкалоидов сангвинарина и хелетрина), экстракт травы зверобоя (действующие флавоноиды - гиперазид и рутин) и противовирусное средство - Гипорамин (экстракт из листьев облепихи - действующие БАВ - таннины). Установлено, что соотношение скоростей ферментативных реакций на заявляемых объектах - цитохроме Р-450 и глутатионтрансферазе - после и до добавления препаратов, не обладающих антитоксическими свойствами, меньше 1, что отличает их от препаратов с антитоксическими свойствами (табл.2).

ПРИМЕР 3. Влияние веществ с адаптогенной активностью на скорости реакций, катализируемых цитохромом Р-450 и глютатионтрансферазой, in vitro.

Скорость реакций заявленных ферментов определяли как в примере 1.

Использовали экстракты женьшеня и элеутерококка, известные своими адаптогенными свойствами, обусловленными содержащимися в них гликозидами - панаксозидами и элеутерозидами. Как было установлено на заявляемых ферментных in vitro адаптогенные вещества активируют ГТФ-азную реакцию глутатионтрансферазы и N-деметилазную реакцию цитохрома Р-450, при этом соотношение скоростей реакций после и до добавления экстрактов больше 1, что характерно для веществ, обладающих антитоксическими свойствами (табл.3).

ПРИМЕР 4. Влияние лекарственного средства ФитоНово-Сед на скорости реакций, катализируемых цитохромом Р-450 и глютатионтрансферазой, in vitro и при системном введении.

Скорости реакций заявленных ферментов в исследованиях in vitro определяли как в примере 1. В опытах на животных при внутрежелудочном введении в течение 3-х недель в дозе 10 мг/кг веса животного лекарственного средства ФитоНово-Сед использовали белых беспородных крыс весом 180-200 г с алкогольной интоксикацией, вызванной длительным в течение 1,5 месяцев приемом 10% этанола. Затем животных декапитировали, брали печень и выделяли из нее микросомальную фракцию по методу (Куразина И.И., Бачманова Г.И. и др. - Биохимия, 1979, т.4, стр.1049-1057) контролем в опыте служили животные с алкогольной интоксикацией, не получавшие ФитоНово-Сед. В микросомальных фракциях, выделенных из печени опытных и контрольных крыс, определяли скорости реакций, катализируемые цитохромом Р-450 и глутантионтрансферазой способом, описанным в примере 1.

Лекарственное средство ФитоНово-Сед, обладающее седативным и анксиолитическим действием, является комплексным препаратом, состоящим из экстрактов травы пустырника, мелиссы, эхиноции, плодов боярышника и шиповника. В исследованиях in vitro препарат изучали в двух формах: жидкий экстракт и тонкодисперстный сухой экстракт. Как было установлено, при использовании ферментных тест-систем - цитохрома Р-450 и глутантионтрансферазы - ФитоНово-Сед вызывает повышение скоростей реакций как при непосредственном взаимодействии веществ в опытах in vitro, так и при системном введении крысам с алкогольной интоксикацией в дозе 10 мл/кг веса крысы (табл.4).

При системном введении лекарственного средства ФитоНово-Сед скорости реакций, катализируемые цитохромом Р-450 и глютатионтрансферазой были выше скоростей реакций аналогичных ферментов микросом печени крыс, не получавших препарат. Соотношение скоростей ферментативных реакций, катализируемых цитохромом Р-450 и глютатионтрансферазой, в опыте и контроле было больше 1.

Установленные in vitro антитоксические свойства ФитоНово-Сед подтверждаются в исследованиях in vivo, проведенных на животных.

Следовательно, способ выявления биологически активных веществ, обладающих антитоксической активностью, на заявляемых двух ферментных системах in vitro, позволяет добиться высокой степени точности при определении искомой активности.

Таблица 1
Влияние гепатопротекторных препаратов на скорость реакций, катализируемых цитохромом Р- 450 и глутатионтрансферазой, in vitro
Вариант опыта	Скорость гидроксилирования анилина цит.Р-450 M±m	Скорость деметилирования ДМА цит.Р-450 М±m.	Скорость ГТФ-реакции М±m
нмоль /мг в мин	оп/контр	нмоль/мг в мин	оп/контр	нмоль/мг в мин	оп/контр
Контроль	7,17±0,25	1,00±0,04	9,12±0,30	1,00±0,03	92,87±3,90	0,96±0,04
Карсил 2×10-5 мг/мл	10,04±0,42	1,42±0,06	9,16±0,55	1,00±0,05	111,44±2,60	1,21±0,02
Силимар 2×10-5 мг/мл	11,15±0,31	1,56±0,04	9,13±0,46	1,00±0,05	144,46±2,55	1,56±0,03
Сибектан 2×10-5 мг/мл	9,56±0,14	1,33±0,02	11,98±0,6 6	1,31±0,06	123,52±4,30	1,33±0,05
Примечание: скорость монооксигеназных реакций, катализируемых цитохромом Р-450, выражена в нмоль НАДФН, окисляемого при гидроксилировании анилина и деметилировании ДМА на мг белка микросом в минуту; скорость реакции, катализируемой ГТФ, - в нмоль коньюгата ДНХБ и глутатиона на мг микросомального белка в минуту; оп/контр. - соотношение показателей опыта и контроля.

Таблица 2
Влияние противомикробных и противовирусных препаратов на скорость реакций, катализируемых цитохромом Р-450 и глутатионтрансферезой, in vitro
Вариант Опыта	Скорость гидроксилирования анилина цит.Р-450 М±m	Скорость деметилирования ДМА цит.Р- 450 M±m	Скорость ГТФ-реакции М±m
нмоль/мг в мин	оп./контр.	нмоль/мг в мин	оп./контр.	нмоль /мг в мин	оп./контр.
Контроль	7,17±0,25	1,00±0,04	9,12±0,30	1,00±0,03	92,87±2,9	0,96±0,04
Зверобоя Экстракт 2×10-5 мг/мл	4,78±0,19	0,67±0,04	7,23±0,08	0,79±0,01	91,78±1,53	0,99±0,02
Сангвиритрин 2×10-5 мг/мл	5,50±0,11	0,77±0,02	7,60±0,15	0,83±0,02	89,10±0,09	0,96±0,01
Гипорамин 2×10-5 мг/мл	6,00±0,22	0,83±0,04	8,70±0,20	0,96±0,02	79,59±0,58	0,86±0,07
Примечание: скорость монооксигеназных реакций, катализируемых цитохромом Р-450, выражена в нмоль НАДФН, окисляемого при гидроксилировании анилина и деметилировании ДМА на мг белка микросом в минуту; скорость реакции, катализируемой ГТФ, выражена в нмоль коньюгата ДНХБ и глутатиона на мг микросомального белка в минуту; оп./контр. - соотношение показателей опыта и контроля.

Таблица 3
Влияние веществ с адаптагенными свойствами на скорость реакций, катализируемых цитохромом Р-450 и глутатионтрансферазой, in vitro.
Варианты опыта	Скорость гидроксилирования анилина цит.Р-450. M±m	Скорость деметилирования ДМА цит.Р-450. M±m	Скорость ГТФ-реакции М±m
нмоль /мгв мин	оп./конт р.	нмоль/м г в мин	оп./контр.	нмоль/ мг в мин	оп./контр.
Контроль	7,44±0,15	1,00±0,02	9,12±0,30	1,00±0,03	86,68±1,90	0,98±0,02
Женьшень (экстракт корня) 2×10-5 мг/мл	7,72±0,08	1,03±0,01	12,54±0,20	1,38±0,02	123,82±0,90	1,43±0,07
Элеутерококк (экстракт корня) 2×10-5 мг/мл	7,37±0,05	0,99±0,07	14,34±0,20	1,57±0,01	120,58±1,50	1,39±0,01
Примечание: скорость монооксигеназных реакций, катализируемых цитохромом Р-450, выражена в нмоль НАДФН, окисляемого при гидроксилировании анилина и деметилировании ДМА на мг микросомального белка в минуту; скорость реакции, катализируемой ГТФ, выражена в нмоль коньюгата ДНХБ и глутатиона на мг микросомального белка в минуту; оп./контр - отношение показателей опыта и контроля.

Таблица 4
Влияние препарата ФитоНово-Сед на скорость реакций, катализируемых цитохромом Р-450 и глутатионтрансферазой, in vitro и при системном введении крысам с экспериментальным алкоголизмом.
Варианты опытов с ФитоНово-Сед (концентрация в пробе)	Скорость гидроксилирования анилина цит.Р-450 М±m	Скорость деметилирования ДМА цит.Р-450 М±m	Скорость ГТФ-реакции М±m
нмоль /мг в мин	оп./ко нтр.	нмоль/мг в мин	оп./контр.	нмоль/мг в мин	оп./контр.
Контроль ФитоНово-Сед раствор (5×10-5 мл)	6,27±0,20	1,00±0,03	10,03±0,32	1,00±0,04	108,27±3,34	0,96±0,04
8,36±0,25	1,33±0,04	10,13±0,09	1,01±0,08	144,48± 4,53	1,34±0,05
Контроль ФитоНово-Сед порошок (5×10-4 мг/мл)	10,62±0,62	1,00±0,09	12,53±0,81	1,00±0,03	118,20±5,30	0,98±0,02
18,93±0,67	1,20±0,04	20,16±0,90	1,61±0,07	183,20±7,34	1,55±0,04
Системное введение крысам
Контроль ФитоНово-Сед жидк. 10 мл/кг	8,40±0,22	1,00± 0,02	9,13±0,26	1,00±0,02	54,24±0,91	0,99±0,01
12,20±0,91	1,45±0,01	14,34±1,10	1,57±0,01	108,40±7,93	2,00±0,08
Примечание: скорость монооксигеназных реакций, катализируемых цитохромом Р-450, выражена в нмоль НАДФН, окисляемого при гидроксилировании анилина и деметилировании ДМА на мг микросомального белка в минуту; скорость реакции, катализируемой ГТФ, выражена в нмоль коньюгата ДНХБ и глутатиона на мг микросомального белка в минуту; оп./контр. - отношение показателей опыта и контроля.

Способ выявления антитоксических свойств биологически активных веществ, заключающийся в воздействии исследуемого вещества на цитохром Р-450, определении скорости ферментативной реакции и оценке полученного результата, отличающийся тем, что исследуемым веществом дополнительно воздействуют на глутатионтрансферазу, определяют скорость ферментативной реакции до и после воздействия, а оценку результатов проводят по соотношению скоростей ферментативных реакций после и до воздействия исследуемого вещества, при соотношении, большем 1, делают заключение о наличии антитоксических свойств, а при соотношении, равном или меньшем 1, делают заключение об отсутствии антитоксических свойств.