Способ получения антивирусного препарата из дрожжей
Изобретение относится к технологии получения биологически активных препаратов . Цель изобретения - упрощение технологического процесса получения антивирусного препарата из дрожжей и повышение выхода биомассы продукта. Для этого отделенные от культуральной жидкости и высушенные клетки гомогенизируют, растворимые вещества из гомогената экстрагируют 5-6%-ной уксусной кислотой, центрифугируют и осадок отбрасывают. Экстракт упаривают в вакууме при 50°С и охлаждают, целевой продукт из концентрата осаждают двумя объемами этанола, центрифугируют , осадок растворяют в воде и высушивают сублимацией. 9 табл.
союз советских
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 А 61 К 35/76
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 0 (ОЧ, 0 (д
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4405765/13 (22) 07.04.88 (46) 30,06.91.Бюл. М 24 (713 Институт микробиологии и вирусологии им,Д.К,Заболотного (72) А.Г.Коваленко, А,Д.Бобырь, Т.Д.Грабина и А,А.Баркалова (53) 577.15.072:632.981(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР
М 687120, кл, С 12 P 1/02, 1979, Авторское свидетельство СССР
Ь 302368, кл. С 12 P 1/02, 1971. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ДРОЖЖЕЙ
Изобретение относится к технологии получения биологически активных препара-. тов для растениеводства и животноводства.
Цель изобретения — упрощение технологического процесса получения антивирусного препарата из дрожжей и повышение выхода биомассы продукта.
Цель достигается тем, что вместо рибонуклеазы и фенола для очистки препарата используют органическую кислоту, предпочтительно уксусную, выполняющую одновременно и функцию активного экстрагента. Кислота применяется в концентрации 5-8fo, не снижающей активности, получаемого препарата. но обеспечивающей его-высокий выход и хорошую очистку от примесей. По предлагаемому способу в качестве исходного сырья можно использовать не только дрожжевую биомассу, выращенную в лабораторных ус,. Ы„„1659053 А1 (57) Изобретение относится к технологии получения биологически активных препаратов. Цель изобретения — упрощение технологического процесса получения антивирусного препарата из дрожжей и повышение выхода биомассы продукта. Для этого отделенные от культуральной жидкости и высушенные клетки гомогенизируют, растворимые вещества из гомогената экетрагируют 5-67,-ной уксусной кислотой, центрифугируют и осадок отбрасывают, Экстракт упаривают в вакууме при 50 С и охлаждают, целевой продукт из концентрата осаждают двумя объемами этанола, центрифугируют, осадок растворяют в воде и высушивают сублимацией. 9 табл. ловиях, но и промышленные. кормовые дрожжи.
Отделенные от культуральной жидкости и высушенные клетки гомогенизируют, растворимые вещества из гомогената экстрагируют 5 — 67-ной уксусной кислотой, центрифугируют и осадок отбрасывают.
Экстракт упаривают в вакууме при 50 С и охлаждают, целевой продукт из концентрата осаждают двумя объемами этанола, центрифугируют, осадок растворяют в теплой воде и высушивают сублимацией.
Выделенные данным способом препараты состоят преимущественно из полисахаридов, хорошо растворимы в воде и обладают высокой антивирусной активностью.
Пример 1. Дрожжи Сапб!ба tropicalis
К-41 выращивают в ферментерах на аэрированной жидкой среде следующего состава: (NH 1659053 КНрРО4 1 г/л; К2Н РО4 0,1 г/л; гл юкоза 25 г/л; биотин 2 мкг/л. Биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин), высушивают в сублимационной сушке (ЗЬ С, давление — 10 н/м ) и используют по мФре получения антивирусного препарата. Дрожжевые клетки гомогенизируют с помощью шаровой мельницы, растворимые вещества экстрагируют 6 -ной уксусной кИслотой (2 ч при+2 С), осадок отбрасываю, а надосадочную жидкость доводят до н йтрального значения рН добавлением 5 н Ne0H и концентрируют 1:5 упариванием о (50 С) в вакууме. К охлажденному концентр добавляют 2 объема 96%-ного этанола и, осаждают целевой продукт при +20C, Осадрк собирают центрифугированием и растворяют в теплой (50 С) дистиллированной вОде. Раствор центрифугируют, осадок отб эасывают, а препарат сушат в сублимационной сушке, Выход очищенного препарата составляет 5,7% сухого веса дрожжей. Препарат имеет вид аморфного белого порошка. хорощо растворим в воде, термостабилен, не г 4гроскопичен и может длительно храниться в сухом месте беэ изменения порошковидной консистенции и высокой антивирусной активности, В его составе боrice 80 углеводов, примесь белков составляет не. более 3%, нуклеиновых кислот— следы, Пример 2. В качестве исходного материала используют сухие кормовые дрожжи промышленного изготовления, Экстракцию и очистку антивирусного начала проводят по той же схеме, что и в примере 1. Для этого применяют уксусную кислоту в 5 -ной концентрации. Выход препарата несколько ниже (4,9 ), однако антивирусная активность его выше, чем при экстра.кции 6 -ной кислотой. Препарат представляет собой аморфный порошок слабокоричневого цвета, хорошо растворим в воде, термостабилен, не гигроскопичен и может долго храниться в сухом месте без потери физических характеристик и антивирусной активности, Состоит преимущественно из полисахаридов, примеси белкой не превышают 5ф„нуклеиновых кислот— 0,4 . Пример 3, Исходное сырье — промышленные кормовые дрожжи, Для экстракции и очистки антивирусного препарата исполь° эуют уксусную кислоту в оптимальной концентрации (5,5$). Выход препарата достаточно высок -5,2, его антивирусная активность выше, чем при экстракции веществ 6 -ной уксусной кислотой, В табл.1 приводятся сведения о составе и активности препаратов, полученных из различных источников, в отношении вируса табачной мозаики на дурмане. Пример 4. Сухие дрожжевые клетки (40 r) обрабатывают 6 -ной уксусной кислотой по предлагаемому способу или водой (по прототипу). Растворимые вещества отделяют центрифугированием и в полученных экстрактах определяют содержание углеводов (0,2 -ным антроном в концентрированной HzS04) и белков (по микрометоду Бредфорда), а также антивирусную активкость экстрактов (против ВТМ на листьях дурмана). Данные этого опыта приводятся в табл.2,3,4. Целевой продукт, экстрагированный 6%-ной уксусной кислотой, по антивирусной активности существенно не отличается от продукта, полученного согласно способупрототипу. Тем не менее содержание углеводов, являющихся действующим началом препарата, в этом препарате в 1,5 раза. выше, чем в препарате, экстрагированном водой. В то же время большую долю (31 ) последнего составляют белки, содержание которых в целевом продукте, экстрагированном 6 -ной уксусной кислотой, не превышает 2 А. Пример 5. 250 мг дрожжевых клеток Candida tropicalis К-41- высушенных лио35 фильно, гомогенизируют и целевой продукт из них экстрагируют 3 -, 5 -, 60 -, 8 -, 10 - или 15 -ной уксусной кислотой. Далее экстракт концентрируют упариванием в вакууме, осаждают спиртом. Определяют 40 суммарное содержание белков и полисахаридов в препаратах и их способность ингибировать инфекционность ВТМ на листьях дурмана. Данные этого опыта, приведенные в 45 табл.5, показывают, что по мере увеличения концентрации уксусной кислоты с 3 до 107 выход полисахаридов повышается, а выход белков, наоборот, снижается (с 3,4 до 1,47;). Дальнейшее увеличение концентрации кис50 лоты (до 15 ) сопровождается снижением выхода полисахаридов, Антивирусной активностью обладают все препараты. Однако наиболее высокую активность отмечают у . препаратов, экстрагированных 5-6 -ной 55 уксусной кислотой. Препараты, выделенные при более высокой концентрации кислоты (8-15$) в сравнимо низких (1 мкг/мл) концентрациях, не обладают активностью либо эта активность непостоянна. Намного мень- ней оказалась и активность препарата, экс1659053 10 25 35 40. дня между смежными обработками. Учиты50 55 трагированного 3 -ной уксусной кислотой, вероятно, из-за присутствия примесей, сни-. жающих активность ингибиторов, либо стимулирующих инфекционность вируса. При испытании действия различных концентраций уксусной кислоты в качестве экстрагента целевого продукта в данном опыте нейтрализация ее щелочью сознательно не проводилась. Это дало возможность определить, насколько высокие концентрации водородных ионов могут отрицательно повлиять на активность антивирусного начала. Измерения показывают, что заданные определенной концентрацией кислоты значения рН существенно не ïîâûшаются в процессе концентрирования экстракта в вакууме благодаря испарению кислоты. Так, при концентрации кислоты 56 значение рН экстракта после концентрирования продукта в вакууме не выходит за пределы 1 — 2, при этом антивирусная активность целевого продукта (no сравнению с более низкой концентрацией экстрагента — 3 ) ) не уменьшалась, Таким образом, оптимальная концентрация уксусной кислоты, обеспечивающая достаточно высокий выход препарата, отсутствие в нем существенных примесей сопутствующих белков и хорошую сохранность антивирусной активности целевого продукта, находится в пределах 5-ба. Пример 6. В опыте используют сухие клетки дрожжей Candida tropicalls К вЂ” 41. . Получение антивирусного препарата по предлагаемому способу, 40 г дрожжевых клеток гомогенизируют и целевой продукт экстрагируют 400 мл 6 фной уксусной кислоты (2 ч при температуре + 20 С), экстракт отделяют от гомогената клеток центрифугированием и упаривают до 100 мл в вакууме. Целевой продукт из концентрата осаждают, двумя объемами спирта, осадок растворяют в воде и лиофилиэируют. На всех стадиях получения препарата определяют содержание углеводов, 4 белков в экстрактах и антивирусную активность экстрагируемых веществ. Получение антивирусного препарата по способу-прототипу, 40 г дрожжевых клеток гомогенизируют, целевой продукт экстрагируют 400 мл воды (2 ч при температуре +20 С), экстракт от гомогената клеток отделяют центрифугированием, а затем обрабатывают его РНКазой в концентрации 20 мкг/Mll (2 ч, +25ОC в 0,001 M NaCI). Экстракт концентрируют в вакууме до 100 мл, а затем эмульгируют в смеси фенола и хлороформа (9;1) в течение 30 мин при комнатной температуре, водную фазу с целевым продуктом отделяют центрифугированием и подвергают диализу (24 ч) против воды. Целевой продукт из диализата осаждают 5 объемами этилового спирта. осадок растворяют в воде и лиофиливируют, На всех стадиях получения препарата определяют содержание белков и углеводов в экстрактах и антивирусную активность экстрагируемых веществ. Данные сравнительной оценки предлагаемого способа и его прототипа приводятся в табл,6. Выход препарата, полученного по предлагаемому способу, в условиях этого опыта достигает 2,5 В то время как, используя способ — прототип, удается получить лишь около 0,7 ь препарата от веса исходного сырья. Пример 7. Листья дурмана обрабатывают препаратом (1 мгlмл) за 48 ч до или сразу после заражения Х-вирусом картофеля (ХВК} путем погружения их в раствор испытуемого препарата. Контрольные листья аналогичным образом обрабатывают водой. Инфекционный титр вируса определяют через 5 дней посредством инокуляции экстрактами из . листьев дурмана растений Gomphrena globosa и подсчетом образовавшихся в опыте и контроле местных вирусных поражений. Данные, приведенные в.табл.7, свидетельствуют о существенном профилактическом эффекте в отношении ХВК. Отмечено снижение титра вируса (на 317,) под влиянием препара;а. В системе табак — вирус бронзовости томатов (ВБТ) полученный антивирусный препарат (АВП) применяют путем трехкратного опрыскивания растений до (профилактика) или после (терапия) инокуляции их инфекционным соком с интервалом 2-3 вают количество местных некрозов на инокулированных листьях, а также число системно пораженных растений, отмечают одновременно характер и степень проявления внешних симптомов заболевания. Данные этого опыта приведены в таблицах 8 и 9. Как следует из приведенных результатов, полученный АВП обладает высоким профилактическим и существенным терапевтическим (снижение гибели растений на 50 при 100%-ной гибели их в контроле) действием в отношении болезни табака, вызываемой В6Т. Формула изобретения Способ получения антивирусного препарата иэ дрожжей, включающий культивировакие клеток, их отделение от культуральной жидкости, экстракцию очи1659053 упрощения технологического процесса и повышения выхода биомассы продукта, экстракцию и очистку проводят уксусной кислотой в концентрации 5-6 . Таблица 1. Выход, состав и антивирусная активность препаратов, выделенных их дрожжей Концентрация препарата, мкг/мл Состав и епа ата, Выход препарата, ф Исходный материал PHK белки углеводы 5,7 3,0 97 76 82,5 следы 0.4 5,0 35,0 4,9 91 76 Таблица 2 Характеристика целевого продукта, экстрагированного из 40 г сухих дрожжей различными способами белков от суммы биополимеров Содержание биополимеров в экстрактах, мг Антивирусная активность Экстракция используе- ингибировамая концент- ние BTM на рация; листьях дурмкг/мл мана, белков углеводов сумма 6 -ной уксусной кислоты 93 6 80 8 41 й7 1,9. 1 141,4 1120 21,4 Водой (по прототипу) 31,0 378 1218 840 98 5 90 4 33 +12 П р и м е ч а н и е, Концентрация расчитывалась по содержанию углеводов s препарате. стку, и концентрирование экстракта в вакууме с последующим осаждением целевого продукта и его сублимационным высушиванием,отличающийся тем,что,сцелью Клетки дрожжей СапсИда troplcalls К вЂ” 41, выращенные в лабораторных условиях Кормовые дрожжи, полученные в производственныхусловиях Ингибирование инфекционности виру. са табачной мозаики на листьях дурмана, 1659053 Таблица 3 Моносахаридный состав антивирусных препаратов, полученных с помощью известного и предлагаемого способа Со е жанне моносаха и а, Способ манноза галактоза амноза глюкоза 0,7 0,8 2,3 2,2 2,6 сле ы Предлагаемый П ототип 96,4 97,0 П р и м е ч а н и е. Содержание маносахаридов в препаратах определяют с помощью газо-жидкостной хроматографии. Препараты для ГЖХ получают путем гидролиза антивирусного препарата в 2 н серной кислоте (2 ч, 100 С). Таблица 4 Действие гидролаз на антивирусную активность антивирусного препарата, выделенного из дрожжей с помощью заявленного способа. Инфекционность ВТМ (некрозов на I лист мана Ферментная обработка Ингибирование вируса. в опыте в конт оле 0,8 99 3 Таблица 5 Выход и антивирусная активность целевого продукта. экстрагированного из дрожжевых клеток уксусной кислотой различной концентрации Интактный препарат (контроль) Препарат обработан ДНКазой РНКазой трипсином глюканазой маннаназой смесью мэннаназа +глюканаза 1,2 1,4 0,9 21 32 81 92 72 88 84 98 +5 98 ч-4 99 -2 76 9 65 й11 1659053 Продолжение табл, 5 * стимуляция инфекционности Способ ыделено из 40 r клеток, мг Х белко от обгибироние ннтадия получения препаата спользу мые коннтрацни о угле дам), мкт /мл кционносВТМ на стьях урмана, Х щего кол жества бнополнелков углеводов итого мер ов 1,9 75 I Экстракция 6Х-ной уксусной кислотой Предлагаewe 93+ 6 111,4 81 8 П Упарнвание в вакууме 1809,2 0,5 75 1800 9,2 Ш Осакдение спиртом 1000 7,2 1007,2 0,7 75 Прото- 1 тип Экстракция водой, обработанной РНКазой (20 мкг/мл в 0,001 М NaC1) 378,0 840 1218 31,0 75 234, О 1700 II Упаривание в вакууме 1934 12 1 75 Ш Обработка фенольнохлороформной смесью, диализ, осалденпе спиртом 303,6 4,5 75 13,6 290 Таблица,6 Сравнительная эффективность двух способов получения антивирусного препарата из клеток драакей СапйЫа tropicalis К-4 1 42 » 7 94 - 3 78 - 7 62 12 95+ 3 621 12 60 12 97+ 5 90Х 4 33 «+.12 96Х 2 67+ 10 75 16 98Х 3 91+ 4 62» 24 1659053 Та 6 ли.ца 7 Действие антивирусного преперата (ЛВП) из дрожжей на накопление Х-вируса картофеля в изолированных половинках листьев дурмана Время инкубации половинок листьев АВП, 1 мг/ил, Ингибирование, Х Вода 48 ч до инокуляции 48 ч после инокуляции +++ Г.<0,! Х; Р 5Õ Таблица 8 Профилактическое действие антивирусного препарата из дрожжей на поражаемость табака сорта Иммунный 580 ВБТ ". Количество местных поражений/листВариант 100 11,0Й 1,4 1,7Ф 0,03 + трехкраное опрыскивание растений с интервалом 3 дня до ннокуляции растений ВБТ. Т а б л и ц а 9 Терапевтическое антивирусное действне антивирусного препарата иэ дрожжей в системе табак сорта Иммунный 580 — ВБТ Вариант Колисество растений, Х 50 дней п.и. 30 дней п.и. 10 дней п.и. Вода (контроль) 100 0 АВП, 0,02Х 37,5 62,5 37,5 11 трехкратное опрыскивание с интервалом .2 дня, начатое сразу после заражения растений ВБТ: 1 — с суровыми симптомами; 2 — с мягкими симптомами; 2 — погибиие. Составитель С.Пылова Техред М,Моргентал Корректор T.Êîëá Редактор В.Ковтун Заказ 1799 Тираж 464 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Вода (контроль) АВП, 0,02Х Инфекционность экстрактов иэ листьев через 5 дней после заражения (некрозов) лист 35 24 31,4 39 40 +1,0 Количество растений с системными симптомами болезни, Z 0 )00 0 0 100 62,5 0 !2,5 . 37,5 50 0
