Штамм бактерий viвriо сноlеrае сноlеrае - продуцент дермонекротического фактора
Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии. Целью изобретения является штамм VIBRIO CHOLERAE CHOLERAE В - 53 - 2 - 38, стабильно продуцирующий дермонекротический фактор в больших количествах. Штамм получен при длительных пасажах в бульоне Мартена, а затем на полужидком агаре с 1%-ной О-холерной сывороткой и депонирован во ВНИПЧИ "Микроб" под NKM-107 дермотоксина на искусственных питательных средах. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
f ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР lgqg g _#_e
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4690912/13 (22) 16.05.89 (46) 15,08,91, Бюл. ¹ 30 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) О.И.Помукина и В.С.Уралева (53) 616 г 32 (088 8) (56) Бактсриальные токсины. M . 1987, с, 117 — 121. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE
CHOLERAE — ПРОДУЦЕНТ ДЕРМОНЕКРОТИЧЕСКОГО ФАКТОРА
Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии.
Цель изобретения — штамм Vibrio cholerae
cholerae В-53-2-38, способный стабильно и в больших количествах продуцировать ДНФ, безопасный в режимном отношении.
Штамм V. cholerae В-53-2-38 получен при длительных пассажах типичного штамма в щелочном бульоне Мартена, а затем на полужидком агаре с 1%-ной коммерческой
О-холерной сывороткой и депонирован в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института "Микроб" под номером
КМ-107.
Штамм характеризуется следующими свойствами.
Культурально-морфологические. В мазках из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Граму, клетки имеют вид рамотрицательных полиморфных слегка изогнутых и прямых палочек. Подвижен при росте в 0,3 ь-ном агаре Мартена.
На щелочном агаре Мартена при 37 С через 18 ч формирует колонии правильной округлой формы диаметром 2 мм с влажной блестящей поверхностью, прозрачные, голубоватые в проходящем свете. На щелоч„„Я2„„1669980 А1 (л1)5 С 12 N 1/20, А 61 К 39/106 (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии. Целью изобретения является штамм Vibrio cholerae
cholerae В-53-2-38, стабильно продуцирующий дермонекротический фактор в больших количествах. Штамм получен при длительных пассажах в бульоне Мартена, а затем на полужидком агаре с 1 ь-ной О-холерной сывороткой и депонирован во ВНИПЧИ
"Микроб" под № КМ-107 дермотоксина на искусственных питательных средах. 1 табл. ном бульоне — помутнение с нежной пленкой.
Биохимические. Штамм ферментирует глюкозу в аэробных и анаэробных условиях с образованием кислоты без газа, а также маннит, сахарозу, крахмал. Не расщепляет арабинозу, манноэу. лактозу, не образует сероводород, ацетилметилкарбинол, образует индол, обладает лизиндекарбоксилазой и не обладает дигидролазой аргинина.
Устойчив к 30 мкг полимиксина. не агглютинирует куриные эритроциты, Фаготипические. Штамм лизируется диагностическим классическим монофагом до рабочего разведения (10 э). Фагами эльтор и ХДФ-3. 4, 5 не лиэируется.
Серологические. Штамм не агглютинируется видоспецифической О-холерной сывороткой. Сывороткой RO агглютинируется до 1/4 титра, Непостоянно агглютинируется типоспецифическими сыворотками Инаба до 1/4 титра и Огава до 1/8 титра.
Ауксотроф. Стабильно вырабатывает
ДНФ в больших количествах, максимальный титр по кожной пробе 1/128. чаще 1/64.
Пример 1. Из суточной агаровой культуры готовят густую взвесь холерных
1669980 вибрионов и по 0.2 мл засевают на 20 чашек щелочного агара Мартена (рН 7,6), на поверхность которого наложены прокипяченные в течение 30 мин кружки целлофана. Культуру на мембране распределяют равномерным раскатыванием и, не переворачивая чашки, помещают их в термастат, выращивают при
37 С 24 ч. Затем на поверхность целлофана наливают пипеткой 2 мл физиологического раствора, осторожно смывают культуру шпателем и пипеткой отсасывают в пробирку, После этого определяют концентрацию вибрионов, которая должна быть не ниже 20 млрд. в 1 мл. К взвесям культур добавляют тиомерсал натрия до конечной концентрации 1:5000, хорошо перемешивают и оставляют в холодильнике до следующего дня, . После этого проверяют на специфическую стерильность, Обеззараженный материал центрифугируют при 6000 об/мин в течение
20 мин.
Для постоянства кожной пробы берут бесклеточный супернатант, Кожную пробу ставят на взрослых кроликах весом не менее 2,5 кг с белой здоровой кожей без крупных родимых пятен.
Накануне постановки опыта тщательно выбривают кожу животного на боках и спине.
Исследуемый материал титруют в физиологическом растворе двукратно от 1/2 до
1/128. Каждое разведение вводят строго внутрикожно, дублированно в два участка кожи в обьеме 0,1 мл туберкулиновым шприцем. Расстояыие между уколами не менее 3 см. Параллельно ставят контрольные пробы с физиологическим раствором, содержащим тиомерсал натрия в том же разведении, что и в опыте.
Первый учет результатов проводят через 24 ч. В положительных случаях на месте инъекции образуется эона некроза, которая распологается в центре папулы с эритемой.
Если она имеет диаметр 2-4 мм, реакция оценивается как слабоположительная, 5-10
45 мм — положительная и более 10 мм — резко положительная, Поскольку размеры зоны некроза не всегда удается определить достаточно четко, кролику вводят внутривенно
2 -ный раствор синьки Эванса из расчета 1 мл на 1 кг веса кролика как контрастирующее вещество, Последующий учет результатов проводят через 3 ч. В зону некроза синька не проникает, и она четко видна на фоне окрашенной кожи. В отрицательных случаях образуется папула с эритемой без эоны некроза, Воэможность выявления ДНФ зависит в известной мере от реактивности кроликов, поэтому рекомендуется использовать для опыта не менее двух особей.
Заключение о способности этого штамма продуцировать ДНФ дается на основании обнаружения его в кожной пробе при использовании укаэанных методик в титре не ниже 1/16.
В качестве контроля используют холерный штамм V. cholerae 569 В, Результаты приведены в таблице, Пример 2. Суточную агаровую культуру штамма КМ-107 засевают во флаконы емкостью 100 мл с 10 мл бульона Мартена (рН
7,6). Посевная доза 100 тыс. м.к. на 1 мл среды, Посевы выращивают при 37 С трое суток, затем культуры вибрионов убивают тиомерсалом натрия до конечной концентрации 1:5000 и далее поступают так, как описано в примере 1.
Очищенный препарат дермонекротического фактора может быть использован для дальнейшего выяснения его роли в патогенезе холеры, обусловленной типичными и измененными штаммами холерных вибрионов, при конструировании вакцинных препаратов, для получения на его основе диагностикумов и антисывороток.
Формула изобретения
Штамм бактерий Vibrio cholerae cholerae
KM 107 -продуцент дермонекротического фактора.
1669980
I 1
1 I
1 4Ч
1 43
Ч \ an
I Л
О О! I
I Л
CO CO
С С
4Ч N
О О
N 4Ч
C CO .Ч
CO C4 СЧ
el
С
lC и а
l4
О
In (\ н
4 \
1 1
4 \ Л
an an
3Л
О Л /\ ln
С \
1 1
Э
О О
ГЧ N
О О
О О
N N Ф
CO
\ Ъ
I 1
O CO
СЧ 1 4
О О
О О
N N CO
\ \
1 1
Э
4 л
СЧ N
4 л
4Ч N
Т I4
С 4 N N л т
N N
N 1 1
40 IC
41 l4
1 Cl
4 4
C В
an 0 О
1 ° О а ) In
Э
4I
Э
C CO
0 Оа
О
) И
1l
CO C
О 0
Э
441
Э 4I
III O1 Э
44 4 14
Э I
° 4Ч °
О 1 р
Л 41 д
Ц ln ц
Ф
С! 4О
Ii г
Э 1
О 1
\ ц an
) Ф
4 Ъ й
44 Э
4I ? а в
4I Э
Р О4
I4 Э
Ct
4 °
1 1 1 1 I 1 1 1
1 1 1 I 1 1 1 1
1 1 I 1 1 1 I
1 4 I 1 1 I 1 1
1 W 1 1 I 1 1 1
CO 4О I 1 1 1 I 1
Ф Ф 1 1 1 1 1 I
О О
4Л и \ I I I 1
О О О О л л 4ч 44 I 1 1 1
О О О О
1 I » «! 1
4 Ъ 41 О 4Ч
4 4 I I Ф CO N N I I и и и
Cl 4I
IC и 14
Э ?
11 О и и х
М ЭЭ и О и О и
Ц
t! и
44
4!
44 и
Э О
4l t:
Ю
Э
4I CI
0 14
О а
С -Э и
Э
l4 О и Э
