Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к гликопротеиду е1 вируса восточного энцефаломиелита лошадей

 

Изобретение относится к вирусологии и гибридомной технологии и может быть использовано в диагностических целях. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток, секретирующих моноклональные антитела (МонАТ) с высокой аффинностью, специфичные к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ), с помощью которых можно типировать вирус ВсЭЛ среди альфавирусов и флавивирусов. Штамм гибридных мышиных перевиваемых клеток ВНИИ МБ - 197, 7В6 получают слиянием клеток мышиной миеломы Р3/NSI - AG 4 с клетками селезенки сингенного животного, иммунизированного вирусом ВсЭЛ, южный вариант. Гибридома 7В6 секретирует моноклональные антитела, IGG1, специфически взаимодействующие с гликопротеидом Е1. Штамм гибридных клеток растет в виде стационарной суспензии и вызывает асцитную опухоль у мышей BALB/C. Продуктивность в асцитной жидкости 1:100000 - 1:200000. Штамм хранится под номером ВСКК N 410 Д. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 И Б/18

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPGKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4642737/13 (22) 27.01.89 (46) 23.08.91. Бюл. М 31 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) А.В.Перебоев, Е.В.Агапов, И.A.Ðàçóìîâ и В.Б.Локтев (53) 578.085.23(088.8) (56) Roehrig J Т. et, al — Biology, 1980, v. 101, Ф 1, р. 41 — 49. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ !IUS IIUSCULUS L.

ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬ11ЫХ АНТИТЕЛ К

ГЛИКОПРОТЕИДУ F.1 ВИРУСА ВОСТОЧЧОГО

ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ЛОШАДЕЙ (57) Изобретение относится к вирусологии и гибридомнои технологии и может быть использовано в диагностических целях. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивиИзобретение относится к вирусологии и гибридомной технологии и может быть использовано в диагностических целях.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток, секретирующих моноклональные антитела (MDHAT) с высокой аффинностью, специфичные к вирусу восточчого энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ), с помощью которых можно типировать вирус ВсЭл среди альфавирусов и флавивирусов.

Штамм получают следующим образом.

Проводят слияние миеломных клеток мышиной природы РЗ/NS — 1 — Ag4(NS-1) с.,ЯО 1671688 А1 руемых клеток, секретирующих монокло— нал ьные антитела (МонАТ) с высокой аффинностью, специфичные к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ), с помощью которых можно типировать вирус ВсЭЛ среди альфавирусов и флавивирусов. Штамм гибридных мыши— ных перепиваемых -:леток ВНИИ МБ- 197, 7В6 получают слиянием леток мьппиной миеломы P3/MSI-Ag 4 с клет-:àìè селе †зенки сингенного животного, иммунизированного вирусом ВсЭЛ, южный вариант. Гибридома 7В6 секретирует МонАТ

IgG 1 специфически взаимодействующие с гликопротеидом Е1. Штамм гибридных клеток растет в виде стационарной суспензии и вызывает асцитную опухоль у мышей BALB/c. Продуктивность в асцитной жидкости 1:100000-1:200000.

Штамм хранится под номером BCKK(ll)

М 410D. 1 табл. клетками селезенки мышей BALB/ñ, им— мунизированных вирусом ВсЭЛ. Иммунизацию проводят по следующей схеме.

Мышей заражают 10 БОЕ вируса ВсЭЛ внутрибрюшинно. Выжившим мьппам на

14,-й и 28-й день вводят по 20 мкг очищенного вируса ВсЭЛ в полном адъюванте Фрейнда. На 42-й день внутривенно вводят 10 мкг вируса. На 4-й день после внутривенного введения вируса мьппей забивают с помощью хлороформа и в стерильных условиях извлекают селезенки, из которых готовят клеточную суспензию.

1671688

Для сл««ÿø.ë ««r:ïñì«h çv«î÷ . ., / 10 сев лезенсч««««х клеток и 4, 5х10 клс ток миело. ы NS-1. Смесь клеток центрифу— гир уют, супер натант т.:дательно удаляют и к клеточному осадку добавляют

400 мкл 5с)7-ного полиэтилен гликоля с мол. массой 1000 (ПЭГ 1000) в среде

ДМЕМ. Смесь це««три«««угируют 4, 5 мин при 600 g. Через 8 мин после добавле- 1ð ния ПЭГ в пробирку медленно добавляют

5 мл среды ДМЕМ и осторожно перемешивают. После этого добавляют еще 10 мл среды ДМЕМ и це««трийугируют 5 мин.

Клеточный оса сок ресуспендируют в "pe- 5 де ДМЕМ с 10 М гипоксантина, 4х10 М тимидина, 4х10 М глицина и 10 H аминоптерина (с елективная среда ГАТГ) .

Гибридому 7В6 отбирают по принципу секреции в культуральную среду иммуно-20 глобулинов, специфически связывающихся с вирусом ВсЭЛ. Отбор проводят методом твердофазного радиоиммунного анализа (ТРИА). Отобранную гибридому дважды субклонируют методом предель- 25 ных разведений, переводят в массовую культуру, подвергают криоконсервации и изучают основные свойства.

Таким образом, штамм гибридной клеточной линии 786 представляет собой 3р трижды клонированную клеточную куль— туру, секретирующую МонАТ к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей.

Штамм гибридных клеток 7В6 хранится под номером BCKK(l 410D и харак 35 теризуется следующими признаками.

Культуральные свойства.

Среда культивирования - среда Игла

MEN в модификации Дульбекко (Д;1ЕМ), содержащая увеличенные количества ар- 40 гинина до 200 мг/л, фолиевой кислоты до 12 мг/л, аспарагина до 36 Mr/ë а также 5 10 М 2-меркаптоэтанола и

10 М НЕРЕЯ с 157. сыворотки плода коровы и «О мкг/ «JI сульфата гентами — 45 цина. Гибридома 7В6 представляет собой монослойно-суспензионную культуру, в которой только часть клеток (приблизительно 807).лрикрепляется к поверхноcти кgëьтуральнои пос ды ° По 5р севная доза 2х10 кл/мл. Частота пассирования — через 3 — 4 сут. Оптимальные условия для роста гибридомы 7В6 создаются при культивировании при

37 С в атмосфере 57 СО«. Клетки с поверхности снимаются энергичным встряхиванием.

Введение в брюшную полость пристан-обработанных м«ппей ВА1.В/с 10 кле7 ток гибрндомы 7Вб индуцирует p;«зн««тис асцита.

Морфологические призна ки .

Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных ио «орйологии и размерам с исходной родительской миеломой NS — 1. Овальное ядро расположено эксцентрично и занимает значительную часть цитоплазмы.

Криоконсервация клеток.

Гибридома 7В6 заморожена на пятом пассаже. Общее количество ампул 20.

В каждой ампуле содержится 5 — 10х

6 х10 клеток. Криозащитная среда — среда ДМЕМ с 407 сыворотки плода коровы и 107 диметилсульфоксида. Выживаемость клеток при разморозке — до 807. с сохранением способности секреции специфических антител. При проверке музейной закладки грибковая и бактериальная контаминация не обнаружена.

Свойства МонАТ, секретируемых штаммом гибридной клеточной линии 7В6.

Гибридома 7Â6 секретирует иммуноглобулины субкласса IgG 1. Определение класса и субкласса иммуноглобулинов проводят методом двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони с использованием антисывороток против различных субклассов мьппиных иммуноглобулинов. Методом иммуноблотинга установлено, что МонАТ 7В6 специфически реагируют с гликопротеидом Е1 вируса АсЭЛ. Титры МонАТ в асцитических жидкостях составляют 1:1000001:200000. МонАТ, синтезируемые гибридомой 7В6, являются специфичными исключительно к вир1 су ВСЭЛ, что показано в ТРИА.

Пример 1. Получение МонАТ к вирусу ВсЭЛ путем культивирования клеток линии 7В6 in vivo.

В культуральный сосуд емкостью

250 мл вносят 30 мл среды ДМЕМ с 157 сыворотки плода коровы содержащей

Э бх10 клеток гибридомы 7В6 и инкубио

У руют при 37 С в течение 3 сут. Выращенные клетки снимают энергичным стряхиванием. Клеточную суспензию центрифугируют 5 мин при 600 g. Клеточный осадок суспендируют в 3 — 5 мл среды ДМЕМ и определяют концентрацию клеток с помощью камеры Горяева.

10 клеток вводят внутрибрюшинно мыс шам BALB/с, за неделю до того сенсибилизированных внутрибрюшным введением 0,5 мп пристана. Через 10— с

16716

12 дней у мышей развивается «с ..ит.

От однои мыши можно пол нить 3 — 5 мл асцитической iKlIIIKoc Tlf содержащей

Г1онЛТ с титром 1:243000 и клетки гибУ 5 ридомы 7В6 н концентрации 5 — 20х

6 х10 кл/мл. Клетки можно использовать для введения следующей партии животных. Асцитическую жидкость, как препарат, содержащий МонАТ, pachacosbma- 10 ют и хранят при -20 С. Приниваемость о клеток гибридомы 7В6 составляет 1007.

Пример 2 . Изучение специфичност:r МонАТ, секретируемых штаммом гибридной клеточной линии 7В6. 15

Специфичность 11онАТ 7В6 устанавливают методом ТРИА с использованием панели из четырех вирусных антигенов.

Панель включает в себя следующие вирусы: вирус восточного энцефаломиелита лошадей (южный вариант); вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей, штамм ТС-83; вирус клещевого энцефаломиелита, штамм 205; вирус эктромелии, штамм К-1.

По 400 нг каждого вируса фиксируют при помощи этанола в лунках 96-луночных микроплат. Для проведения ТРИА используют МонАТ 7В6, иммунную сыворотку мыши против вируса ВсЭЛ, МонАТ, 30

ЗЕ11, Е6В, 7Е2. Все разведения готовят на 17-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) на физрастворе, забуференном 10мМ трис-HC1 (pH

7,2) и содержащем О,0 17 твин-20 (ЗФРтвин). В лунки с фиксированным антигеном вносят по 50 мкл различных разведений ИонАУ, в качестве контроля используют лунки с нанесенным БСА.

Далее платы инкубируют в течение t ч 40 о при 37 С и трижды отмывают ЗФР-твин.

Затем в лунки вносят по 50 мкл кроличьей антисыворотки против мышиных иммуноглобулинов в разведении 1:500 и инкубируют 1 ч при 37 С. Плату трижды отмывают ЗФР†тв и добавляют

125 меченый I — белок А в количестве

2х10 расп/мин (50 мкл) и выдерживают н течение ночи при 4 С. После трехкратной промывки ЗФР†тв диссоци- 50 ируют меченые иммунные комплексы 2М раствором КОН, переносят содержимое каждой лунки в счетные пробирки и определяют радиоактивноСть проб с помощью гамма-счетчика. Полученные результаты представлены в таблице.

Таким образом, полученный на основе мышиной миеломы штамм гибридной клеточной линии 7В6 продуцирует высокоаффинные МонАТ, специфически взаимо55 действующие с вирусом восточного энцефаломиелита лошадеи. С их помощью можно типировать вирус ВсЭЛ среди альфаи флавивирусов. Гибридома 7В6 обеспечивает получение мышиных иммуногло—

Анализ данных показывает, что имеется ряд общих антигенных детерминант у различных аlIüôa — !! *.<анинирс г,iã.

Г1онЛТ, синтезируемьн гибридом н< 7Вь, распознают детерминантс, присушуHl исключительно вирусу В<.ЭД. Выло:!!lt!! ные контроли подтверждают адекватность выбранной панели вирусных антигенов.

Пример 3. Опр< деление нирус— ного белка, специ<Ьиче< .ки рсагирую— щеro с МонАТ, синтезиру емыми гибридомой 7В6.

Вирусньп1 белок — мишень для Г1онЛТ

7В6 определяют методам иммуноблотинга Белки вируса ВсЭЛ, разделенные электрофорезом в полиакриламид <ом гс— ле, переносят из геля на нитроцелнюлозную мембрану. Перенос проводят н течение 4 ч при напряжении 25 В в

0,025 М трис-НС1 буфере (рН 8,3), со— держащем 0,192 М глицина. Контроль переноса белков на нитроцеллюлозу осуществляют прокрашиванием одной полоски мембраны амидочсрным 10 B. Остальные полоски помещают в 10 мГ1 трис-НС1 буфер (р H 7, 2), содержащий

1Е БСА и 0,14 M NaC1, на 16 ч при 4 С.

Обработанные таким образом полоски о инкубируют в течение часа при 37 С с препаратами МонАТ в разведении

1:100. От избытка антител освобождаются трехкратным промыванием мембран

ЗФР-твин. Далее мембраны обрабатывают кроличьей антисынороткой к мьппиным

IgG в разведении 1:500 в течение 1 ч при 37 С. После промывки полоски мемо бран помещают в раствор белка А, коньюгированного с пероксидазой хрена (0,2 МЕ/мл в 17 БСА на ЗФР), и выдерживают в течение ночи при 4 С. Далее полоски промывают и помещают в раствор субстрата, содержащего 0,25 мг/мл о-диадинизина в 10 MM трис-НС1 буфере рН 7,2 и 0,017 перекиси водорода.

В местах образования иммунных комплексов МонАТ и вирусного белка наблюдают появление буро-коричневых полос. МонАТ 7В6 специфически реагируют с гликопротеидом Е1 вируса ВсЭЛ.

1671688 були«он субкласса 1РГ 1 с титрами

1:100000-1:200000 в количесгве 3

5 мл асцитической жидкости на привитую мышь. А«титсла специфически реагируют с гликопротеидом Е1 вируса

ВсЭЛ и не реагируют с другими исследованными тогавирусами.

Титры а«тите« (обратные величины) Вирус

Иммунная сы- МонАТ ЗЕ11 Мо«АТ Е6В МонАТ 7Е2 воротка против вируса

Всэл

Мо«АТ 7В6

243000 (100

4000

C. 100

128000 (100 (1000

64000 (100

< 11)0 (100

1000 (100 (100 (100 а 100

64000

П р и м е ч а н и е. МонАТ 7В6 — моноклональные антитела, синтезируемые гибридомой 7В6, асцит.

Иммунная сыворотка против вируса ВсЭЛ вЂ” сыворотка мыши, иммунизированной 3 раза по 20 мкг очищенного вируса ВсЭЛ. МонАТ ЗЕ11 — моноклональные антитела, синтезируемые гибридомой ЗЕ11, полученной к вирусу

ВЭЛ. Мо«АТ Е6 — к вирусу клещевого энцефалита.

МонАТ 7Е2 — к вирусу эктромелии.!

:остав «тель А. Маныкин

Т ехред М . Дидык Корректор M. Самборская

Редактор И.Лербак

Заказ 2803 Тираж 361 Подписное

ВН>%ПИ Государствен«ого комитет» по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производств. «и. -и дательск«й комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Вс ЭЛ

ВЭЛ

Клещевого

l э нцефалита < 100

Эктромелии

Ф о р м у л а и з о б р е т е « и я

П!тамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus

ВСКК (If)-410D — продуцент моноклональных антител к гликопротеиду F.f вируса восточного э«цефаломиелита лошадей.