Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l., продуцирующий моноклональные антитела к поверхностному белку коронавируса крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к гибридомной биотехнологии и может быть использовано для диагностики желудочно-кишечных заболеваний животных, вызываемых коронавирусом. Цель изобретения - получение штамма гибридных клеток, который продуцирует моноклональные антитела (монат) к поверхностному белку коронавируса крупного рогатого скота (КРС). Штамм получают гибридизацией миеломных клеток линии Х63Ад 86.5.3. со спленоцитами мышей, иммунизированных коронавирусом крупного рогатого скота. Полученный штамм ЗД<SB POS="POST">1</SB>Д<SB POS="POST">4</SB> секретирует МонАТ JGG2B специфически взаимодействующие с гликопротеином коронавируса КРС. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 374Д и характеризуется типичными для гибрида культуральными свойствами: среда культивиров ания RPMI - 1640 с 10%-ной эмориональной сывороткой теленка, посевная концентрация 2<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">5</SP> кл./мл, частота пассирования - через 2 - 3 сут. Продуктивность штамма 10 мкг/мл МонАТ в культуральной среде и 8 мг/мл в асците.

COIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4738008/13 (22) 16.05.89 (46) 07,07;91. Бюл. ¹ 25 (71) Целиноградский сельскохозяйственный институт, Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Всесоюзный научноисследовательский институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р,Коваленко (72) К.К.Муканов, В,А.Несмеянов, M.M.Ãîãîлев, Н.Л.Соколова, Г.А.Надточей, А.К,Булашев и Т.Г.Байтубаев (53) 578,085.23(088.8) (56) D.Derect et al Jourrial General Virology, 1987, к 68, р,2853-2877. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕMblX КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L., ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АТИТЕЛА К ПОВЕРХНОСТНОМУ БЕЛКУ КОРОНАВИРУСА КРУПНОГО

РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к гибридомнойбиотехнологии и может быть использовано

Изобретение относится к гибридомной биотехнологии и может быть использовано для диагностики желудочно-кишечных заболеваний животных, вызываемых коронавирусом, Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, который продукцирует моноклональные антитела (МонАТ) к поверхностному белку коронавируса крупного рогатого скота (КРС).

Штамм получают следующим образом.

Клетки миеломной линии X63Ag 86,5,3. гибридизуют со спленоцитами мышей, иммунизированных 4 раза с двухнедельным интервалом очищенным ультрацентирифугированием в градиенте плотности сахаро., Ж 1661231 А1

<я)5 С 12 N 5/18, А 61 К 39/395 для диагностики желудочно-кишечных заболеваний животных, вызываемых коронавирусом. Цель изобретения — получение штамма гибридных клеток, который продуцирует моноклональные антитела (МонАТ) к поверхностному белку коронавируса крупного рогатого скота (КРС). Штамм получают гибридизацией миеломных клеток линии

Х63А g86.5.3, со спленоцитами мышей, иммунизированных коронавирусом крупного рогатого скота. Полученный штамм ЗД1 Д4 секретирует МонАТ Jg G2b, специфически взаимодействующие с гликопротеином коронавируса KPC. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 374Д и характеризуется типичными для гибрида культуральными свойствами: среда культивирования RPM11640 с 10%-ной эмбриональной сывороткой теленка, посевная концентрация 2х10 кл/мл, частота пассирования — через 2-3 сут.

Продуктивность штамма 10 мкг/мл МонАТ в культуральной среде и 8 мг/мл в асците, зы коронавирусом крупного рогатого скота штамма "КЛ-2", Первую иммунизацию про- . ) водят 50 мкг коронавирусного антигена с ( полным адьювантом Фрейнда, вторую и третью иммунизации такой же дозой антигена с неполным адьювантом Фрейнда. Последнюю иммунизацию проводят 50 мкг антигена в 0,15М фосфатно-буферном растворе и через 3 дня клетки селезенки используют для гибридизации. Гибридизацию проводят добавлением к смеси 4х10 миеломных клеток,и 28х10 спленоцитов 1 мл раствора, содержащего 45% ПЭ Г-4000, 10% диметилсульфоксида и 45% среды RPMI—

1640, Сливающий агент вносят в течение 15 с, затем медленно перемешивают клетки в

1661231 течение 60 с и в течение 15 с добавляют 10 мл среды RPMI — 1640, После этого оставляют для инкубации на 10 мин. Далее клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин, Осадок клеток 5 ресуспендируют в среде RPMl — 1640 с добавлением 10об Д эмбриональной сыворотки теленка и высевают в 96-луночные планшеты по 100 мкл на лунку. На второй день после слияния добавляют селективную 10 среду и гипоксэнтином, аминоптерином и тимидином (ГАТ). Через 10-14 дней из лунок, где выросли клоны клеток, отбирают культуральную жидкость для тестирования на активность, т,е, на продукцию антител, 15

Продукцию специфических антител, синтезируемых гибридными клетками, определяют методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием кроличьих антител к иммуноглобулинам мышей, коньюгиро- 20 ванных с пероксидазой хрена и коронавирусного антигена, очищенного в градиенте плотности сахарозы, Гибридные клетки, продуцирующие МонАт, клонируют 2 раза методом лимитирующих разведений. После 25 второго клонирования 1007ь субклонов продуцируют антитела к тестируемому энтигену. Штамм клеток секретирует антитела в культуральную среду или асцитную жидкость. 30

Штамм гибридных клеток.3 Д1Д4 хра нится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН

СССР под- номером ВСКК/П/%374Д. 35

Штамм характеризуется следующими свойствами..

Морфологическая характеристика.

Культура состоит из слэбоприкрепляющихся к субстрату округлых клеток разме-. 40 ром с исходную миеломную клетку,.Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка, Культуральные свойства.

Среда культивирования;среда RPMI — 45

1640 с добавлением следующих компонентов; 10об g эмбирональной сыворотки теленка; 20 мл/л 200 мМ Z = глютаминэ; НЕРЕЯ

3,375 г/л 0;5 мл/л 0,1М 2 = меркаптоэтанола; 1х10 M пирувата натрия; 100 ед/мл пе- 50 нициллина; 10 мкг/мл стрептомицина; 3,7 г/л бикарбонэтэ натрия, Клетки культивируют при 37 С в атмосфера с 5,(> С02. Характер роста — стационарная суспензия, Посевная концентрация клеток 2х10 55 5 кл./мл, Частота пассирования — через 2-3 сут. При внутрибрюшинной прививке сингенным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 10-14 день.

Доза клеток при: прививке -2х 10 клеток, За

7-14дней до введения гибридомы необходимо инъецировать животным 2,6,10,14=тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на голову.

Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклонал ьн ые антитела в течение 5 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения), Продуктивность штамма.

На 3-5 день культивирования гибридом ы концентрация (МонАТ) достигает

10мкгlмл в культуральной среде. В очищенной асцитной жидкости концентрация иммуноглобулинов.составляет 8 мг/мл.

Характеристика полезного продукта, (IVIoHAT)oTHocsITcfl к иммуноглобултинам подкласса G2 b.(MORAT)ñïåöèôè÷åñêè взаимодействуют с гликопротеином (гликолизированная мономерная форма гемагглютинина) с м.мас.62 КДа. Спецйфичность определяют методом иммуноблотингэ.

Контаминация.

Контаминантов в клетках, включая бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы, не обнаружено.

Криоконсервация.

К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку теленка, а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10 . Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2х10 клеток в б объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на 1 сутки при—

70 С, затем переносят в жидкий азот.

Условия размораживания.

Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню на 37ОС. Как только растают последние кусочки льда, суспензию клеток переносят стерильной пипеткой в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды, отмывают 1 раз и засевают в ячейки 24-луночкой планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее

70 О/, Штамм ЗД1Д4 используют следующим. образом, Пример 1. Гибридные клетки помещают в пластиковые матрасы площадью 25 см

2 по 5х10 кл, в 5 мл питательной среды, инкубируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере с 5

C0z, Культуральную среду собирают центрифугированием 10 мин при 800g для отделения клеток от надосадочной жидкости— супернатантэ, содержащего антитела. При культивировании гибридомы на мышах иммуноглобулины из асцитной жидкости получают осаждением сульфатом аммония до

50% насыщения. Для этого в асцитную жид1661231 кость добавляют равный объем 0,15 M фосфатно-буферного раствора (ФБР), рН 7,2.

Затем добавляют также равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при

4 С. Иммуноглобулины отделяют центрифугированием при 50009 в течение 30 мин при

4 С, Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ФБР. Далее очистку антител проводят на колонке с протеин-А-сефарозой CL-4B. Для этого на уравновешенную связывающим буфером колонку (1,5 M — глицин, 3 MNaCI äoBîäÿ T до рН 8,9 $-MNaOH) вносят по 4 мг/Mn осажденных сульфатом аммония препаратов иммуноглоЬ линов, колонку промывают связывающйм буфером и антитела элюируют 0,1 М лимонной кислотой, рК 4. Элюат нейтрализуют 1М три-НС1 буфером, рН 8,1.

Очищенный препарат антител концентрируют ультрафильтрацией через мембрану РМ

10. Получен н ые и репараты — супер натант и очищенную.асцитную жидкость.— используют как реагенты для изучения специфичности взаимодействия (МонАТ) стестируемым антигеном с помощью метода ИФА.

Пример 2. На полистирольной 96-луночной планшет сорбирают очищенный коронавирусный антиген в концентрации 1 мкг в 100 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера, рН 9,5, инкубируют при 4 С в течение ночи.

Планшет отмывают 3 раза 0,15 М ФБР и 3 раза 0,15 М ФБР с 0 1% Твином-20 (ФБРТв), затем в ячейки планшета вносят двукратные разведения культуральной среды или очищенной асцитной жидкости в количестве 100 мкл и инкубируют в течение 90 мин при 37 С. Планшет отмывают, как описано выше, и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, коньюгированные -с пероксидазой хрена.

Через 1 ч инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции. Связавшийся коньюгат, а значит, и антитела против коронавируса определяют количественно по распаду субстрата НгОз в присутствии ортофенилендиамина. Учитывают результат по интенсивности окрашивания смеси в желто-коричневый цвет, счищают на спектрофотометре с вертикальным потоком света при длине волны 492 нм. Результаты ИФА показывают, что если титр антител в культуральнай среде в первый день пересева гибродомы составляет 1:8, То после 3 суток титр повышается до 1:256, Титр антител в очищенной асцитной жидкости равняется

1:512000. Это свидетельствует о том, что гибридома продуцирует спецйфические моноклональные антитела к коронавирусу крупного рогатого скота.

Пример 3. Для определения молекулярной массы белка вируса, к которому получены моноклональные антитела, проводят

10 электрофорез и перенос вирусных белков на нитроцеллюлозные мембраны с последующим иммунохимическим проявлением (иммуноблотинг). Электрофорез белков проводят в 10%-ном полиакриламидном reток животных Mus musculus 1. ВСКК(П) ¹

374Д, продуцирующий моноклональные антитела к поверхностному белку коронавиру50 са крупного рогатого скота, ле в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия. Перенос вирусных белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят методом полусухого электроблотинга в аппа20 рате при силе тока 0,8 А на см геля в течение 2 ч. Перенесенные на нитроцеллюлозную мембрану белки окрашивают 0,5%ным раствором амидочерного. Часть нитроцеллюлозной мембраны используют

25 для иммунохимического проявления антителами. Для этого нитроцеллюлозную мембрану инкубируют в 1%-ном бычьем сыворочном альбумине(БСА) втечение ночи при 4 С, затем обрабатывают очищенными

30 препаратами антител в разведении 1:100 и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре с антителами кролика против иммуноглобулинов мыши, коньюгированными с пероксидазой хрена. Реакцию визу35 ализируют инкубацией нитроцеллюлозных мембран в растворе следующего состава: 4 мг хлорнафтола; 1 мл метанола; 5 мл ФБР;

5 мкл 30%-ного раствора перекиси водорода.

При электрофорезе обнаруживают бел40 ки с мас.170, 100, 62, 53 и 23 кДа. После иммунохимического проявления белков, lie ренесенных на нитроцеллюлозные мембраны, обнаруживается одна полоса м.мас. 62 кДа, что указывает на то, что моноклональ45 ные антитела специфически связываются.с вирусным белком м.мас.62 кДа.

Формул изобретения

Штамм гибридных культивируемых кле