Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к мембранному антигену мyсорlаsма arginini

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики микоплазм-контаминантов в культурах клеток. Штамм получают слиянием клеток миеломы мышей SP2/0-Ag с клетками селезенки мышей BALB/C, иммунизированных мембранным антигеном M.arglnini. Клетки растут на среде ДМЭМ с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ пирувата натрия, 2% глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина, частота пассирования 1-2 сут, индекс рассева V2-V3. Клетки продуцируют Мои AT, специфичные к антигену Mycoplasma arginini, титр Мои AT в иммуноферментном тесте составляет 1-128-1 256

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4700421/13 (22) 20.06.89 (46) 30.05,91. Бюл. М 20 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им.й.Р.Коваленко (72) Л.П,Дьяконов, Ю.Н,Федоров, И.Л.Куликова и Т.А.Феоктистова (53) 578.085.23(088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUCULUS !.=ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

К МЕМБРАННОМУ АНТИГЕНУ MYCOPLASMA

ARGININI (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагноИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики микоплазм-контаминантов в культурах клеток, Штамм получают следующим образом, леткл иелом мышей SP2/O А 14 сливают с клетками селезенки мышей

BALB/С, иммунизированных четырехкратно (100 мкг) мембранным антигеном

M.argInini, выделенным из культур клеток.

Сливание клеток проводят через 3 дня после последней внутривенной иммунизации с помощью ПЭГ-4.000. Клетки миеломы и спленоциты смешивают в соотношении

1:5 — 1:10 по общепринятой методике.

Селекцию гибридом проводят на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин.

Гибридом ы вы ра щи в а ют на 96-луночных плашках на среде ДМЭМ с 10 g, фетальÄÄ59ÄÄ 1652339 А1 (s!)s С 12 N 5/18, С 12 Р 21/08 стики микоплазм-контаминантов в культурах клеток. Штамм получают слиянием клеток миеломы мышей SP2/0-Ag с клетками

14 селезенки мышей BALB/Ñ, иммунизированных мембранным антигеном М,arginini, Клетки растут на среде ДМЭМ с добавлением 10% фетальной сывороткй крупного рогатого скота, 1 мМ пирувата натрия, 2 глутамина, 100 мкгlмл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина. частота пассирования

1 — 2 сут, индекс рассева 1:2 — 1:3. Клетки продуцируют Мон AT, специфичные к антигену Mycoplasma arginini, титр Мон AT в иммуноферментном тесте составляет

1:128-1:256. ной сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере с 5 (, СО2.

Тестирование гибридом на продукцию антител проводят методом ИФА с использованием антимышиных коныюгатов, а также„ мембранного антигена препаратом микоплазм М.агц!и!и!.

Реклонирование проводят на плашках по общепринятой методике. В результате отбирают и размножают клон, продуцирующий моноклональные антитела, которые реагируют с антигеном М.аго!и!и!.

В иммуноферментном тесте перекрестные реакции с другими штаммами микоплазм отсутствуют.

Положительный клон клеток последовательно размножают в 96, 24, 12-луночных плашках, а затем в чашках Петри.

Культуральную жидкость исследуют на содержание специфических антител. Титр

1652339

Составитель A,MàèûêèH

Редактор M.Ïåòðoâà Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор M.Ïoæî

Заказ 1747 Тираж 380 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 специфических антител в иммуноферментном тесте составляет 1:128-1;256.

Препараты моноклональных антител получают 3-кратным осаждением раствором сульфата аммония 50 j-ного насыщения с последующим диалиэом. Определяют классовую принадлежность и специфич. ность моноклональных антител.

Штамм клеток обладает следующими, свойствами.

Морфологические признаки. Клетки округлой формы с большим ядром, слабо прикрепляются к субстрату, размножаются в суспензии.

Культуральные свойства. Клетки растут на среде ДМЭМ с добавлением 10 j, фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ пирувата натрия, 2 глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина. Характер роста — стандартная суспензия, Частота пассирования 1 — 2 сут, индекс рассева 1:2-1:3.

Контаминация. Контаминантов — бактерий, грибов, дрожжей и микоплазм — не обнаруженоо.

Моноклональные антитела определены как иммуноглобулины M-класса.

Хранение культур, Суспенэию клеток в концентрации не менее 5 ° 10 в ампуле эа6 мораживают в среде, содержащей 10 диметилсульфоксидэ, 45О/ среды ДМЭМ инактивированной фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Режим замораживания — снижение температуры на 1 град в

1 мин. Выживаемость клеток после размораживания 60 .

Штамм получил название Ш ГК. МрА. А-1 и депонирован в Институте цитокологии АН

СССР под номером ВСКК(П) N 329D.

Пример 1, Клетки клона пассируют на

5 среде ДМЭМ с 107; сыворотки эмбриона коровы, 1 мМ пирувата натрия в атмосфере с 50/э С02, Титр специфических антител в культуральной жидкости в ИФА составят 1;12810 1:256.

Пример 2, Клетки продуцирующего клона вводят в брюшную полость мышам линии BALE/G, предварительно эа 10 сут праймированным 0,5 мл пристана, по 2 10

15 клеток в 0,5 миллилитровом фосфатно-солевом растворе, На 14 сут получена эсцитнэя жидкость, титр специфических антител в ИФА 0,5 — 1,0

10 .

20 Пример 3. Препараты мопоклональных антител, полученнь1х иэ асцитной и культурэльной жидкостей высаливанием сульфатом аммония 507;-ного насыщения, коньюгируют с пероксидазой из хрена пе25 рийодатным методом в соотношении 1:1 (вес/вес). Рабочее разведение коньюгата в

ИФА с использованием в качестве мембранного антигена M.arginini (100 мкг/лунку) составляет 1;6400. Реакция на другие штаммы

30 микоплазм в ИФА соответствует уровню контроля с неспецифическим белком.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus гпозсфоз L,ÂÑÊÊ(Ï) М

35 329D — продуцент моноклональных антител к мембранному антигену Mycop)asma

arginini.