Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l., продуцирующий моноклональные антитела к нуклеокапсидному белку коронавируса крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для диагностики желудочно-кишечных заболеваний животных, вызываемых коронавирусом. Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующего моноклональные антитела /МоН/АТ/ к нуклеокапсидному белку /НП-53/ коронавируса крупного рогатого скота /КРС/. Штамм получают гибридизацией миеломных клеток линии Х - 63 AG 86. 5. 3 со спленоцитами мышей, иммунизированных коронавирусом крупного рогатого скота. Полученный штамм 3 G<SB POS="POST">6</SB> D<SB POS="POST">5</SB> секрецирует и МонАТ JG2B, специфически взаимодействующие с белком НП - 53 коронавируса КРС. Штамм депонирован под номером ВСКК /П/ 375 Д и характеризуется типичными для гибридов культуральными свойствами: среда культивирования R PMJ - 1640 с 10-ой% эмбриональной сыворотки теленка, посевная концентрация - 2<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">5</SP> клеток в 1 мл, частота пассирования 2 - 3 сут. Продуктивность штамма 10 мкг/мл МонАТ в культуральной среде и 4 мг/мл в асците.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (5))g С 12 N 5/18 С 12 P 21/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЗНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4741186/13 (22) 16.05.89 (46) 30.07.91. Бюп. Р 28 (71) Целиноградский сельскохозяйственный институт, Институт биоорганической химии им. M.M.Utåìÿêèíà и Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.P.Êoâàëåíêo (72). К.К.Муканов, В.А.Несмеянов, М.М.Гоголев, Н.Л.Соколова, Г.А.Надточей, А.К.Булашев и Т.Г.Байтубаев (53) 578.085.23(088„8) (56) Derect D. et а1. — I; Gen.

Virology, 1987, ч. 68, рр. 2853—

2877. (54) HTAMM AfBPHgHblK KYJIbTHBHPyEMblX

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ МПБ14ШБСШХБ 1, ПРО"

ДУЦИРУИЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К

НУКЛЕОКАПСИДНОМУ БЕЛКУ КОРОНАВИРУСА

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к гибри= домной технологии и может быть ис-. пользовано для диагностики желудоч

Изобретение относится к гибридоиной технологии и может быть испоЛьзовано для диагностики желудочнокишечных заболеваний животных, вызываемых коронавирусом.

Цель изобретения — получение штамма гибридных клеток, продуцирующего моноклональные антитела (МонАТ) к нуклеокапсидному белку НП-53 коронавируса крупного рогатого скота (КРС) .

„Я0„„1666532 А 3

2 но=кишечных заболеваний животных, вызываемых коронавирусом. Целью изоб ретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующего мо" ноклональные антитела (монАТ) к нук" леокапсидному белку (НП=53) корона вируса крупного рогатого скота (КРС).

Штамм получают гибридизацией миелом ньм клеток линии Х=63 Ag86.5.3 со спленоцитами мышей, иммунизирован= ных коронавирусом крупного рогатого скота. Полученный штамм 3 С 0 секре цнрует и МонАТ Ig 2b, специфически взаимодействующие с белком НП=53 ко-. ронавируса КРС. Штамм депонирован под номером BCKK(II)375D и характе= а ризуется типичными для гибридов куЛь= туральными свойствами: среда культи вирования RPMI-1640 с 10 об.Ж эмбрио= нальной сыворотки теленка, посевная 1в концентрация 2 ° 10 клеток в 1 мп, частота пассирования 2=3 сут. Продук= тивность штамма 10 мкг/мя МонАТ в культуральной среде и 4 мг/мп в ас= ците.

Ь)

Штамм получают следующим образом.

Клетки миеломной линии Х63 Ag

86.5.3 гибридизуют со спленоцитами мышей, иммунизированных 4 раза с двухнедельным интервалом очищенным 3 ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы коронавирусом КРС штамка "КЛ 2". Первую иммунизацию проводят 50 мкг коронавирусного анти= гена с полным адъювантом Фрейнда, 2 ,.и 3 иммунизацию такой же дозой-анти=

1666532

ze««a с неполным адъювантом Фрейнда.

Последнюю иммунизацию проводят 50 мкг антигена в 0,15 N фосфатно=буферном растворе, рН 7,2, и через 3 дня клет= ки селезенки используют для гибриди=

Зации. Гибридизацию проводят добавле.

«нем к смеси 4 ° 10 миеломных клеток

28 10 спленоцитов 1 мп раствора, содержащего 45% ПЭГ4000, 10% диме= тилсульфоксида и 45% среды RPMI-1640.

Сливающий агент вносят в течение

15 с, затем медленно перемешивают валетки в течение 60 с и в течение 15 с добавляют 10 мл среды RPMI-1640. Затем оставляют для инкубацни на

10 мин. После этого клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мнн в течение 10 мин. Осадок клеток ре= суспендируют в среде RPNI-1640 с до, бавлением 10% по объему эмбриональной, сыворотки теленка и высевают в 96= луночные планшеты по 100 мкл налунку. На второй день после слияния добавляют селективную среду с гиноксанти= ном, амнноптерином и тимидином (ГАТ).

Через 10-. 14 дней из лунок, где вь«росли клоны клеток, отбирают культу= ральную жидкость для тестирования на активность, т.е. на продукцию ан-. тител. Продукцию специфических анти тел, синтезируемых гибридными клетка.ж, определяют методом иммунофер ментного анализа (ИФА) с использова(,.жем кроличьих антител к иммуногло= булинам мышей, конъюгированных с перок сидазой хрена и коронавирусного ан«игена, очищенного в градиенте плотности сахароэы. Гибридные клетки, про-. цуцИРующие ИонАТ, клонируют два раза 40 . методом лимитирующих разведений. После второго клонирования 100% субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм клеток секретирует антитела в культуральную среду нли 45 асцитную жидкость.

Ытамм гибридных клеток 3G

СССР под номером BCKK(II) 3750,.

5Î

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки. Культура состоит из слабоприкрепляющнхся

55 к субстрату округлых кпеток размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Дито ппазма имеет вид тонкого ободка„

Культуральные свойства. Среда культивирования: Среда RPNI-1640 с добавлением следующих компонентов:

10% по объему эмбриональной сыворот ки теленка; 20 мп/л 200 мМ Ь-глюка жна; 3,375 г/л НЕРЕЯ; 0,5 мп/л

0,1 И 2-.меркаптоэтанола; 1 10 М пирувата натрия; 100 ЕД/мп пеницил-. лина, 10 мкг/wz стрептомицина;

3,7 г/л бикарбоната натрия. Клетки культивируют при 37ОС в атмосфере с

5% СО . Характер роста — стацйо= нар ная суспензия. Посевная концент рация клеток 2 10 клеток в 1 мп.

Частота пассирования через 2 3 сут.

При внутрибрюшинной прививке син= генным мышам штамм гибридомы обра= зует опухоль в асцитной cbopMe на

10-14 день. Доза клеток при привяв= ке 2 t0 . 3a 7=14 дней до введения гибридомы необходимо инъецировать животным 2,6, 10, 14 тетраметилпента декан в дозе 0,5 мп на голову. тамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные анти= тела в течение 5 пассажей на сии= генных мышах (время наблндения), Продуктивность штамма„ На 3 5 день культивирования гибридомы концентра= ция ИонАТ достигает 10 мкг/мп в культуральной среде. В очищенной ас= цитной жидкости концентрация иммуно глобулинов составляет 4 мг/мп.

Характеристика полезного продукта.

МонАТ относятся к иммуноглобулинам подкласса G2b. ИонАТ специфически взаимодействуют с нуклеокапсидным белком молекулярной массы 53 КДа.

Специфичность определяют методом чммуноблотинга.

Контаминация. Контаминантов в кпетках, включая бактерии, грибы, дрожжи и микоплазму, не обнаружено.

Криоконсервация. К осадку гибрид ных клеток добавляют эмбриональную сыворотку теленка, а затем диметил= сульфоксид до конечной концентрации

10%. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с за винчивакщимися крьппками по 2 10 клес6 ток в объеме 1 мп. Ампулы помещают в коробку иэ пенопласта и оставляют на сут при -70 С1 затеи переносят в жидкий азот.

Условия размораживания. Заморо женную ампулу быстро помещают в во-. дяную баню на 37 С. Как только рас

5

166653 тают последние кусочки льда, суспен= зию клеток переносят стерильной пи петкой в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточ= ной среды, отмывают один раз и засеS вают в ячейки 24-луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макро= фагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 70 .

Нтамм гибридомы используют сле-. дующим образом.

Пример 1. Гибридные клетки помещают в пластиковые матрасы пло щадью 25 см по 5 10 кл. в 5 мп питательной среды, инкубируют 3=4 дня при 370С в атмосфере с 5 СО . Куль= туральную среду собирают, центрифу= гируют 10 мин при 800 g с целью отде= ления клеток от надосадочной жидкос= 20 ти = супернатанта, содержащего анти тела. При культивировании гибридомы на мышах иммуноглобулины из асцитной жидкости получают осаждением сульфа том аммония до 50 насьпцения. Для 25 этого в асцитную жидкость добавляют равный объем О, 15 М фосфатно=буфер-. ного раствора (ФБР}, рН 7,2. Затем добавляют равный объем насьпценного раствора сульфата аммония и оставляют 30 при перемешиванни на ночь при 4 C.

Иммуноглобулины отделяют центрифуги= рованием при 5000 g в течение 30 мин при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ФБР. Далее очистку антител проводят на колонке с протеин А-сефарозой CL-.4Â. Для это-. го на уравновешенную связывакпцим бу-. фером колонку (1,5 М глицин, 3 N NaC1 доводят до рН 8,95 N Na0H) вносят по 40

4 мг/ип осажденных сульфатом аммония препаратов иммуноглобулинов, колонку промывают связывающим буфером и антитела элюируют О, 1 М лимонной кислотой, рН 4,0. Элюат нейтрализуют 1 М три= 45 НС1 буфером, рН 8,1. Очищенный препарат антител концентрируют ультрафильтрацией через мембрану рМ 10. По-. лученные препараты .- супернатант и очищенную асцитную жидкость исполь= 50 зуют как реагенты для изучения специ= очности взаимодействия МонАТ с тес-. тируемым антигеном с помощью метода

ИФА.

Пример 2. На полистирольный

96-.яуночный планшет сорбируют очи-. щенный коронавирусный антиген в кон центрации 1 мкг в 100 мкл О, 1 И би= карбонатного буфера, рН 9,5, инкуби

6 руя при 4 С в течение ночи. Планшет отмывают 3 раза 0,)5 М ФБР и,3 раза

0,15 ФБР с 0,1 Твином=20 (ФБР=Тв}, затем в ячейки планшета вносят дву кратные разведения культуральной сре= ды нли очищенной асцитной жидкости в количестве 100 мкл и инкубируют в течение 90 мин при 37 С. Планшет отмывают, как описано вьппе,и вносят в ячейки антитела кролика против имму ноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена. Через 1 ч инку= бации при 37 С повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязан ных продуктов реакции. Связавшийся конъюгант, а значит,и антитела против коронавируса определяют коли чественно по распаду субстрата Н О в присутствии ортофенилендиамина.

Учитывают результат по интенсивности окрашивания реакционной смеси в желто-коричневый цвет, считывают на спектрофотометре с вертикальным потоком света при длине волны 492 нм.

Результаты ИФА показывают, что если титр антител в культуральной среде в первый день пересева гибридомы составляет 1:8, то после 3 сут титр повышается до 1 .256. Титр антител в ! очищенной асцитной жидкости равняет ся 1:512000. Это свидетельствует о том, что гибридома продуцирует спе= цнфические МонАТ с коронавирусом

КРС.

Пример 3. МонАТ ЗСР исполь= зуют в варианте "сэндвича" ИФА для количественного определения корона= вирусного антигена. Для этого на по листирольный 96-луночный планшет сорбируют очищенные осаждением суль . фатом аммония ИонАТ в концентрации

1 мкг в 100 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера рН 9,5, инкубируя при 40С в течение ночи. Планшет отмывают,как описано в примере 2. В ячейки планше та вносят двукратные разведения с концентрацией 10 мкг/мп коронавирус ного антигена в объеме 100 мкл и йн кубируют в течение 90 мин при 37 С.

Планшет отмывают и в ячейки вносят вторые МонАТ к короновирусам КРС, конъюгированные с пероксидазой хре= на. При этом на полистирольной по= верхности планшеты образуется комплекс: МонАТ - коронавирусный анти= ген вторые МонАТ, конъюгированные с пероксидазой хрена. Через 1 ч ин кубации при 37 С повторяют процедуру о

7 1666532

Составитель А.Маныкин

Техред М.Моргентал Корректор М.Демчик

Редактоp Н.Киштулинец

3аказ 2498 Тираж 380 Подписное

ВЧИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

° а.Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óàãîðîä, ул. Гагарина,101 отмывки с целью удаления несвязан н х продуктов реакции. Образовавшийся комплекс, а значит, и коронавирус-. йый антиген, определяют количестве но по распаду субстрата К О s npu сутствии ортофенилендиамина. Учитыва-.

Мг результат по интенсивности охра п1ивания реакцнонной смеси В желто коричневый цвет на спектрофотометре с вертикальным потоком света при дяине волны 492 нм. Результаты ИФА показывают, что с использованием

МонАТ в варианте "сэндвича" выявля6т ся до 10 нг/мн вирусного белка.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Musmueculus Ь.

BCKK(II) 3759, продуцирующий моно кпональные антитела к нуклеокапсид ному белку коронавируса крупного ро-. гатого скота.